Summary

Sette passi per Stellate Cellule

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

Qui si descrive un metodo per l'isolamento delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Per la purificazione delle cellule stellate, fegati mouse sono digeriti<em> In situ</em> E<em> In vitro</em> Da pronasi-collagenasi trattamento prima centrifugazione a gradiente di densità. Questa tecnica produce elevata purezza cellule stellate epatiche.

Abstract

Cellule stellate epatiche sono fegato residenti cellule simili a stelle morfologia e si trovano nello spazio di Disse tra fegato e cellule endoteliali sinusoidali 1,2 epatociti. Cellule stellate sono derivati ​​dai precursori del midollo osseo e memorizzare fino a 80% del totale del corpo di vitamina A 1, 2. Dopo l'attivazione, le cellule stellate differenziarsi in miofibroblasti per produrre la matrice extracellulare, contribuendo così alla fibrosi epatica 3. Sulla base delle loro capacità di contrarsi, le cellule stellate myofibroblastic in grado di regolare il tono vascolare associata a ipertensione portale 4. Recentemente, abbiamo dimostrato che le cellule stellate epatiche sono cellule che presentano l'antigene potenti e possono attivare le cellule NKT così come convenzionali linfociti T 5.

Qui vi presentiamo un metodo efficiente per la preparazione delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Grazie alla loro localizzazione perisinusoidal, l'isolamento delle cellule stellate epatiche è un processo multi-step. Al fine di rendere accessibile a cellule stellate isolamento dallo spazio di Disse, fegati mouse sono perfusi in situ con l'pronasi E enzimi digestivi e Collagenasi perfusione P. In seguito, il tessuto epatico viene sottoposto ad ulteriore trattamento enzimatico con pronasi Collagenasi E e P vitro. Successivamente, il metodo sfrutta la massiccia quantità di vitamina A-la memorizzazione gocce lipidiche nelle cellule stellate epatiche. Questa funzione consente la separazione delle cellule stellate da altri tipi di cellule epatiche per centrifugazione su una pendenza dell'8% Nycodenz. Il protocollo qui descritto produce una popolazione altamente pura e omogenea delle cellule stellate. Purezza delle preparazioni può essere valutata dalla colorazione per il marcatore molecola di proteina gliale fibrillare acida (GFAP), prima dell'analisi al microscopio a fluorescenza e citometria a flusso. Inoltre, microscopia luce rivela l'apparizione unica di cellule epatiche stellate a forma di stella che ospitano grandi quantità di goccioline lipidiche.

Nel loro insieme, vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento efficiente delle cellule stellate epatiche, comprese le immagini rappresentative del loro aspetto morfologico e di espressione GFAP che contribuiscono a definire l'entità delle cellule stellate.

Protocol

Topi C57BL / 6 dovrebbero essere usati a ~ 20 settimane di età o più. L'utilizzo di topi maschi del peso 25-30g è raccomandato. La resa di cellule stellate può essere aumentata di alimentazione topi un A-arricchito di vitamina dieta per 2 mesi prima di isolamento delle cellule stellate. Circa 2×10 5 cellule stellate epatiche può essere purificato dal fegato di un C57BL / 6 del mouse, mentre la resa di cellule stellate da topi BALB / c è nettamente superiore. Il protocollo che segue è regolata a 5 t…

Discussion

Cellule stellate epatiche regolano essenziali processi fisiologici e fisiopatologici nel fegato. Inoltre, le cellule stellate possiedono proprietà presentanti l'antigene, rendendoli una componente importante della risposta immunitaria epatica. Sebbene le cellule stellate epatiche costituiscono il 10-15% del numero totale di cellule nel fegato, l'isolamento di queste cellule è impegnativo a causa della loro localizzazione nello spazio di Disse perisinusoidal.

Qui vi presentiamo un m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dalla famiglia Smith Award per l'eccellenza nella ricerca biomedica e NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer e Melanie Flach sono supportati da borse di dottorato da Boehringer Ingelheim Fondazione.

Materials

Name Of Reagent Company Catalog No.
70μm Cell Strainer BD 352350
CaCL2 x 2H2O Sigma-Aldrich C3306
Collagenase P Roche 11249002001
DMEM Gibco 11960
DNase I Roche 10104159001
DPBS Cellgro 21-031-cv
EGTA Fluka 3777
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Gradient Centrifugation Tubes Greiner Bio-One 163160
HEPES Gibco 15630
KCL Sigma-Aldrich P9541
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
L-Glutamine Gibco 25030
MgCl2 x 6H2O Fluka 63068
MgSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich M2773
Na2HPO4 x 2H2O Fluka 71643
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaH2PO4 x H2O Fluka 71507
NaHCO3 Fluka 71628
Nycodenz Accudenz AG AN7050/BLK
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Peristaltic Pump Cole Parmer HV-7523-70
Phenol Red Sigma-Aldrich P4633
Pronase E Calbiochem 7433-2
Silicone Tube Masterflex HV-96440-14
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Tissue culture flask (25cm2) BD 353108
Winged Infusion Set Terumo 1SV27EL

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Cite This Article
Maschmeyer, P., Flach, M., Winau, F. Seven Steps to Stellate Cells. J. Vis. Exp. (51), e2710, doi:10.3791/2710 (2011).

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