Sju steg till stellate celler
Summary
Här beskriver vi en metod för isolering av celler i levern stellate från mus lever. För stellatum cell rening, är musen lever rötas<em> På plats</em> Och<em> In vitro</em> Genom pronase-kollagenas behandling före densitetsgradient centrifugering. Denna teknik ger mycket ren celler nedsatt stellate.
Abstract
Nedsatt stellate celler lever hemmahörande celler av star-liknande morfologi och ligger inom loppet av spridning och annan mellan lever sinusformad endotelceller och hepatocyter 1,2. Stellate celler från benmärg prekursorer och lagra upp till 80% av kroppens totala vitamin A 1, 2. Vid aktivering stellate cellerna differentieras till myofibroblaster att producera extracellulär matrix, vilket bidrar till leverfibros 3. Baserat på deras förmåga att ingå avtal, kan myofibroblastic stellate celler reglerar kärltonus i samband med portal hypertension 4. Nyligen visade vi att levern stellate celler potenta antigenpresenterande celler och kan aktivera NKT celler och konventionella T-lymfocyter 5.
Här presenterar vi en metod för effektiv framställning av celler i levern stellate från mus lever. På grund av sin perisinusoidal lokalisering, är isolering av celler nedsatt stellate en process i flera steg. För att göra stellate celler tillgänglig för isolering från det utrymme för spridning och annan, är musen lever perfusion in situ med matsmältningsenzymer Pronase E och kollagenas P. Efter perfusion är levervävnaden genomgå ytterligare enzymatisk behandling med Pronase E och kollagenas P vitro. Därefter tar metoden nytta av den massiva mängd av vitamin A-lagring lipiddropparna i celler nedsatt stellate. Denna funktion gör att separation av stellate celler från andra typer levern celler genom centrifugering på en 8% Nycodenz lutning. Protokollet som beskrivs här ger en mycket ren och homogen population av stellate celler. Renhet av preparat kan bedömas genom färgning för markören molekylen gliaceller fibrillära surt protein (GFAP) före analys av fluorescensmikroskopi eller flödescytometri. Vidare avslöjar ljusmikroskopi den unika utseende stjärnformade celler i levern stellate som hyser höga halter av fett droppar.
Sammantaget presenterar vi ett detaljerat protokoll för effektiv isolering av celler lever stellatum, inklusive representativa bilder av deras morfologiska utseende och GFAP uttryck som hjälper till att definiera stellate cellen enhet.
Protocol
Discussion
Nedsatt stellate celler reglerar grundläggande fysiologiska och patofysiologiska processer i levern. Dessutom stellate celler har antigenpresenterande egenskaper gör dem en viktig del av nedsatt immunsvar. Även nedsatt stellate cellerna utgör 10-15% av det totala antalet celler i levern, är isolering av dessa celler utmanande på grund av sin lokalisering i perisinusoidal loppet av spridning och annan.
Här presenterar vi en enkel metod att isolera celler nedsatt stellate från mus leve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av familjen Smith Award for Excellence inom biomedicinsk forskning och NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer och Melanie Flach stöds av PhD stipendier från Boehringer Ingelheim Foundation.
Materials
| Name Of Reagent | Company | Catalog No. |
|---|---|---|
| 70μm Cell Strainer | BD | 352350 |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 |
| DMEM | Gibco | 11960 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv |
| EGTA | Fluka | 3777 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 |
| HEPES | Gibco | 15630 |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | HV-7523-70 |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 |
| Silicone Tube | Masterflex | HV-96440-14 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD | 353108 |
| Winged Infusion Set | Terumo | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. i. s. t. o. r. y. heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &. a. m. p. ;. a. m. p., Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e. Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
