Transplante mamária de células estromais e células de carcinoma em camundongos C57BL/6J
Summary
Neste relatório, nós demonstramos um sistema para isolar e cultura de células de doadores da glândula mamária do mouse, e ortotopicamente transplante dessas células em ratos para analisar estroma destinatário: interações epiteliais durante o desenvolvimento do tumor mamário.
Abstract
A influência das células do estroma, incluindo fibroblastos na progressão do tumor mamário tem sido bem documentada por meio do uso de modelos de mouse, em particular através de transplante de células do estroma e células epiteliais na glândula mamária de camundongos. Modelos atuais de transplante freqüentemente envolvem o uso de camundongos imunocomprometidos devido à diferentes origens genéticas das células do estroma e células epiteliais. Matrizes extracelulares são muitas vezes utilizados para incorporar os dois tipos de células diferentes para consistentes interações célula-célula, mas envolvem o uso de Matrigel ou colágeno da cauda de rato, que são substratos imunogênica. A falta de funcionais de células T de camundongos imunocomprometidos impede uma avaliação precisa das células estromais sobre a progressão do tumor mamário in vivo, com importantes implicações no desenvolvimento de medicamentos e eficácia. Além disso, os camundongos imunocomprometidos são caras, difíceis de produzir e requerem condições de cuidados especiais. Para superar estes obstáculos, temos desenvolvido uma abordagem para transplante de células do estroma ortotopicamente e células epiteliais em camundongos da mesma origem genética para induzir a formação de tumor consistente. Este sistema envolve a coleta normal, os fibroblastos carcinoma associados, PyVmT células de carcinoma de mama e de colágeno de camundongos C57BL/6J doador. As células são então incorporados em colágeno e transplantadas nas glândulas mamárias inguinais de camundongos fêmeas C57BL/6J. Transplante de células PyVmT sozinho formar tumores palpáveis pós-transplante 30-40 dias. Análise Endpoint menos 60 dias indica que co-transplante com fibroblastos aumenta o crescimento do tumor mamário em comparação com as células transplantadas PyVmT sozinho. Enquanto as células e matriz de camundongos C57BL/6J foram utilizadas nesses estudos, o isolamento de células e matriz e abordagem transplante pode ser aplicado para ratos de diferentes origens genéticas demonstrando versatilidade. Em resumo, este sistema pode ser usado para investigar as interações moleculares entre as células do estroma e células epiteliais, e supera as limitações críticos em modelos de ratos imunocomprometidos.
Protocol
Discussion
A contribuição funcional de fibroblastos na progressão tumoral tem sido demonstrado através de modelos de transplantes, em que os fibroblastos carcinoma associados co-transplantados com resultados benignos mamários células epiteliais no crescimento do tumor aumentou e invasão 5. Abordagens transplante convencional envolveram o uso de camundongos SCID ou nuas para co-transplante de células do estroma e do epitélio de diferentes origens genéticas do rato ou de espécies diferentes. Ratinhos imunocompr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi financiado através de NIH / NCI número de concessão R00 CA127357 e da Universidade de Kansas Cancer Center Endowment.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| C57BL/6N mice | Harlan | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson laboratories | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | MT-30-001 | |
| amphotericin | fisher | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma AldrichC0130-50 | ||
| hyalronidase | Sigma Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Biorad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher | A406P 4 | |
| betadine | fisher | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher | 12031-07 |
References
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