En enkel droppe cellodling protokoll för generering av 3D spheroids

Summary

Vi beskriver en enkel, snabb metod för att generera 3D vävnad-liknande spheroids och deras potential ansökan att kvantifiera skillnaderna i cell-cell interaktioner.

Abstract

Studier av cell-cell sammanhållning och cell-underlag vidhäftning har historiskt utförts på monolayer kulturer anhängare till styva substrat. Celler i en vävnad, men är vanligtvis inneslutet i ett tätt vävnad massa i vilka celler etablera intima förbindelser med många nära grannar och extracellulära matrix komponenter. Följaktligen kemiska miljö och fysiska krafter som upplevs av celler i en 3D-vävnad är fundamentalt annorlunda än de som upplevs av celler som odlas i monolager kultur. Detta har visat sig påtagligt påverkar cellulär morfologi och signalering. Flera metoder har utformats för att generera 3D cellkulturer, inklusive inkapsling av celler i kollagen geler ¹ eller i biomaterial byggnadsställningar ^2. Sådana metoder, medan användbara, inte rekapitulera inte det intima direkta cell-cell adhesion arkitektur som finns i normal vävnad. Snarare de närmare ungefärliga kultur system där enskilda cellerna är löst spridda inom ett 3D meshwork av ECM-produkter. Här beskriver vi en enkel metod där cellerna är placerade i droppe kultur och inkuberas under fysiologiska förhållanden tills de bildar äkta 3D spheroids i vilka celler i direkt kontakt med varandra och med extracellulära matrix komponenter. Metoden kräver ingen specialutrustning och kan anpassas för att inkludera tillägg av biologiska agens i mycket små mängder som kan vara av intresse för att belysa effekter på cell-cell eller cell-ECM interaktion. Metoden kan också användas för att samarbeta kultur två (eller fler) olika cellpopulationer så att klarlägga vilken roll av cell-cell eller cell-ECM interaktioner i specificera rumsliga relationer mellan celler. Cell-cell sammanhållning och cell-ECM vidhäftning är hörnstenarna i studier av embryonal utveckling, tumör-stromaceller cell interaktion i maligna invasion, sårläkning och för ansökningar till tissue engineering. Denna enkla metod kommer att ge en metod för att generera vävnad-liknande cellulära aggregat för mätning av biomekaniska egenskaper eller för molekylära och biokemiska analyser i en fysiologiskt relevant modell.

Protocol

1. Beredning av en enda cell Fjädring Vidhäftande cellkulturer bör odlas till 90% sammanflödet bör varefter monolager sköljas två gånger med PBS. Efter dränering väl, tillsätt 2 MLS (för 100 mm plattor) på 0,05% trypsin-1 mM EDTA, och inkubera vid 37 ° C tills cellerna lossnar. Sluta trypsinization genom att tillsätta 2 ml av kompletta medium och försiktigt använda en 5 ml-pipetten på mal sönder blandningen tills cellerna är i suspension. Överför celler till en 15 ml koniska rör. <…

Discussion

Studier har visat att odling celler i ett tredimensionellt sammanhang (3D) producerar distinkt cellulär morfologi och signalering jämfört med en stel tvådimensionell (2D) kultur-systemet ^9. Till exempel fibroblast befolkade kollagen geler visa att fibroblast morfologi i 3D är helt skild från den som observerats i 2D ^10,11. Likaså kan 3D kultur framkalla vävnadsspecifika differentiering av bröst epitelceller. 3D-kultur-system har använts för att skilja mellan normala och maligna celler oc…

Materials

• automatic cell counter (BioRad TC10)
• shaking water bath with CO₂ gable cover Model 3540 (Lab-line)