Um procedimento para líquidos baseados em cultura e distribuição de<em> C. elegans</em> Cepas que expressam proteínas fluorescentes repórter é descrito que não requer equipamento caro classificação. Esta abordagem pode ser aplicada a inúmeras induzível<em> C. elegans</em> Genes para a descoberta de drogas ou biosensoriamento de contaminantes.
High-throughput screening (HTS) é uma poderosa abordagem para a identificação de moduladores de química de processos biológicos. No entanto, muitos compostos identificados em telas usando modelos de cultura celular são encontrados frequentemente para ser tóxicos ou farmacologicamente inativas in vivo 1-2. Triagem em modelos animais inteiros pode ajudar a evitar estas armadilhas e agilizar o caminho para o desenvolvimento de drogas.
C. elegans é um organismo multicelular modelo adequado para HTS. Ele é pequeno (<1 mm) e pode ser economicamente cultivadas e distribuídas em líquidos. C. elegans é também um dos modelos animais mais experimentalmente tractable permitindo identificação rápida e detalhada de drogas modo-de-acção 3.
Nós descrevemos um protocolo para cultivo e distribuição de linhagens fluorescentes de C. elegans para high-throughput screening de bibliotecas de química ou de detecção de contaminantes ambientais que alteram a expressão de um gene específico. Um grande número de worms developmentally sincronizado são cultivadas em cultura líquida, colhidas, lavadas e suspensas em uma densidade definida. Worms são então adicionados ao preto, de fundo chato de 384 poços placas utilizando um dispensador peristáltica líquido. Pequenas moléculas de uma biblioteca de produtos químicos ou amostras de teste (por exemplo, água, alimentos, solo ou) podem ser adicionados a poços com worms. In vivo, em tempo real intensidade de fluorescência é medida com um leitor de microplacas de fluorescência. Este método pode ser adaptado a qualquer gene induzível em C. elegans para o qual um repórter está disponível. Estresse induzível muitos caminhos e de desenvolvimento de transcrição são bem definidas em C. elegans e tensões repórter GFP transgênicos já existem em muitos deles 4. Quando combinado com os repórteres apropriado transgênicos, o nosso método pode ser utilizado para triagem de moduladores caminho ou para desenvolver robusto ensaios biosensor para os contaminantes ambientais.
Demonstramos nossa C. elegans cultura e dispensando protocolo com um ensaio HTS que desenvolvemos para monitorar o C. fator 'n' elegans cap transcrição colar SKN-1. SKN-1 e seu homólogo Nrf2 mamíferos ativar genes citoprotetora durante o estresse oxidativo e xenobióticos 50-10. Nrf2 protege mamíferos de várias doenças relacionadas à idade, tais como câncer, neurodegeneração, e inflamação crônica e se tornou um dos principais alvos quimioterápicos 11-13. Nosso ensaio é baseado em um repórter GFP transgênicos para o SKN-1 gene-alvo gst -4 14, que codifica a 6 glutationa-s-transferase. O repórter gst -4 é também um biosensor para produtos químicos xenobióticos e oxidativa que ativam SKN-1 e pode ser usado para detectar baixos níveis de contaminantes, como acrilamida e metil-mercúrio 15-16.
Nós apresentamos um método para cultivo e distribuição de um grande número de nematóides transgênicos. O equipamento utilizado para vermes é padrão para laboratórios de clonagem molecular e da manipulação de líquidos e equipamentos de fluorescência é padrão para os laboratórios de processamento de um grande número de microplacas. Outros métodos de dispensar um grande número de viver C. elegans exigem partículas caros equipamentos de triagem 19. O Pgst-4:: ensaio de G…
The authors have nothing to disclose.
C. elegans transgenes foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 conceder NS0667678-01 a KS. Todos os autores participaram da coleta, análise e interpretação dos dados. CKL, KS, e KPC participaram da elaboração e revisão do manuscrito.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
(5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |