Summary
一个方法是为单身的生活，从不同的脊椎动物物种的荧光成像的感光细胞的准备。该方法可用于图像的内源性荧光基团，如NADH或维生素A，的荧光，或外源性补充钙敏感的荧光染料，
Abstract
在脊椎动物视网膜，phototransduction，光转换为电信号，进行了由杆和锥感光细胞1-4。棒感光器负责在昏暗的光线，在明亮的光线锥的视野。 Phototransduction的感光细胞外，一个专门的车厢，其中包含一个视觉色素，主光探测器的高浓度段的地方。视色素是一个生色，11 - 顺视网膜附着的蛋白质，视蛋白组成。视觉色素吸收光子异构从11生色团- 独联体国家全反式 。这种光致异构化带来了一个启动一个级联反应，最终在膜电位的变化，为电信号的传导光刺激的视觉色素的构象变化。光刺激的细胞恢复涉及的失活，由光激活的中间体和膜电位的重建。的Ca 2 +调节几个phototransduction涉及的酶的活性，减少光刺激后，其浓度。在这样的Ca 2 +在细胞光刺激，其背景光的适应复苏起着重要作用。
恢复过程的另一个重要组成部分，已在光检测摧毁其11的光致异构化的视觉色素的再生-独联体生色全反式5-7。这种再生开始的全反式视网膜的光敏色素的释放，留下的APO -蛋白视蛋白。被释放的全反式视网膜利用NADPH的全反式视黄醇，视蛋白反应迅速减少，结合新鲜的11 -顺视网膜带来改革的视觉色素外段。全反式视黄醇，然后转移到邻近的细胞外段和专门载体Interphotoreceptor维甲酸结合蛋白（IRBP）。
单一的感光细胞的荧光成像可用于他们的生理和细胞生物学研究。的Ca 2 +敏感的荧光染料，可用于详细研究外段的Ca 2 +的变化和反应之间的相互作用 ，以光 8-12以及内心的Ca 2段中的作用的Ca 2 +存储+动态平衡13,14 。荧光染料，也可用于测量镁2 +浓度，pH值，以及水和膜车厢 16示踪剂。最后，全反式视黄醇（维生素A）的内在荧光可以用来监测其形成的动力学和17日至19日在单一的感光细胞去除。
Protocol
1。 Sylgard盖菜，试验室，和刀片的制备
- 35毫米猎鹰的Petri Sylgard弹性体涂层的菜是一个孤立的视网膜上获得单的感光细胞需要适当切碎。根据供应商的说明和少量浇到每道菜，其底部覆盖一层弹性体准备。更换的菜后，涂层覆盖，并将其储存。在几天的时间弹性体变硬的菜都准备好了。
- 隔离光感受器需要坚持的实验室的底部，让他们固定在成像实验的过程中。这是通过涂层与聚- L -赖氨酸或聚- L -鸟氨酸分庭的底部。加入200微升0.01％，其中每室之一的解决方案，并分庭，用纸巾覆盖，防止灰尘。解决方案已经晾干后，用蒸馏水和存储在一个封闭的盒子商会。使用2个星期内。
- 要在一个实验结束时的清洁商会，他们用100％的乙醇删除任何油从油浸镜头和细胞碎片。要去除细胞碎片，用棉签涂药，仔细擦洗室底部。之后，用蒸馏水冲洗，并让钱伯斯干重涂前。
- 切成小块，用金属切割机（8从一个刀片）双刃刀片。
2。准备的解决方案
- 该解决方案的组成取决于品种。对于两栖类动物，林格（mmol / L的）：110氯化钠，氯化钾2.5，1.6 氯化钙 ，氯化镁2，1 5 HEPES，pH值= 7.55 。应调整pH值用NaOH的最终值。对于哺乳动物，林格（mmol / L的）：130氯化钠，氯化钾，0.5，2 MgCl 2的氯化钙 ，25 hemisodium - HEPES，pH值= 7.40。林格氏液可在室温下保存几个月良好的密封。
- 联合葡萄糖溶液，1 mol / L的，保存在-20 ° C，以避免细菌的生长。
- 在一天的实验，添加到终浓度为5 mmol / L葡萄糖林格氏液在这一天结束，丢弃的林格氏液，含有葡萄糖，因为它可能会增长细菌。
3。对视网膜的分离
- 对于适当的视网膜切除重要的是，动物牺牲前至少2-3小时的暗适应。动物应在一个合适的通风容器在暗室暗适应。
- 填补中途林格氏液2张35毫米的培养皿中。
- 昏暗的红灯下牺牲的动物和消除眼睛。随后，所有的程序都使用解剖显微镜或一个视频监控摄像头的红外光下进行。
- 删除任何剩余的组织，从眼睛的外表面。剪切和删除的前部，然后转移到一个充满林格氏培养皿眼罩。
- 取出玻璃体和视网膜仔细分离眼罩的其余部分按捏或切割任何附件。轻轻抬起视网膜和它完全分开的眼罩。
- 视网膜传送到第二个培养皿中，用塑料移液管。保持菜中含有轻紧框视网膜。
4。单一的感光细胞的分离
- 所有的程序下进行红外光。视网膜切小块，用塑料吸管转移到Sylgard盖菜。应包含视网膜片的解决方案的体积约250μL。
- 抓斗一小片刀片与刀座 - 叶片的边缘应在约45 °角向持有人。 Sylgard层上的一块平展的视网膜和使用刀片砍一块视网膜精细，同时保持它坚持Sylgard层。
- 转移200μL含有细胞的实验室的解决方案 - Sylgard覆盖菜留下任何视网膜的剩余部分。保持在光紧中分离出的细胞室。
- 等待10分钟解决的细胞，然后加入2-3毫升林格氏。在这个阶段，可以分离出的细胞装入一个特定的荧光染料（例如FURA - 2）根据染料的加载协议。
- 这些细胞现在可以采取在显微镜阶段的实验。
5。荧光成像
- 传输室epifluorescence显微镜阶段。灌注调整解决方案，温度传感器，红外线照射等。
- 拉上窗帘，开始实验。打开的红外光显微镜内笼，重点实验室的底部，和细胞的移动舞台。
6。代表性的结果S：
图图 1显示了健康的隔离杆，与本议定书获得蝾螈（Ambystoma tigrinum）视网膜锥光感受器的形态。蝾螈的细胞已被广泛用于单细胞荧光成像技术的研究，因为其庞大的规模和其生存的能力，从视网膜分离后的几个小时。此外，从蝾螈视网膜中，可以定期获得杆和锥光感受器。
细胞健康的重要标准之一是存在一个完整的椭圆体（ 图 1），部分细胞线粒体集中。当细胞下的DAPI光学看，这种浓度的线粒体，给人强烈的荧光信号（ 图2）由于NADH的存在。缺乏一个完整的椭球是一个受损细胞的标志，一般不宜用于实验。图。 3显示了一个损坏的蝾螈棒感光，肿胞体和凝结核。这些细胞显示荧光下的DAPI光学低得多，但观看下FITC标记的光学强FAD的信号显示在椭球区域（氧化黄素核苷酸和flavoproteins的）。另一种孤立的光感受器的健康标准是自己的能力产生刺激他们的后外节光全反式视黄醇（维生素A ）。维生素A的生成需要大量的NADPH的，这取决于一个完整的代谢机械。图4和图5显示形成的维生素在一个完整的青蛙和鼠标杆光感受器外节。
图1。健康的单杆和锥光感受器细胞中分离出从虎蝾螈视网膜。 Phototransduction外段和椭球与线粒体密集的包装。棒负责昏暗的灯光下视力，明亮的灯光视觉锥。
图2。荧光生活娃娃鱼杆和锥，这是暗适应细胞，显示在各自的椭球的强烈NADH的荧光，并没有明显的维生素A在其外层细分市场的荧光。荧光图像捕捉可见光，暗适应时间后的第一次接触。
图3。受损的蝾螈杆感光肿胞体和凝结核损害的指标。被氧化的细胞，是最小的NADH的信号（DAPI光学），但更强大的FAD的信号（FITC标记光学）。
图4。 NADH和视黄醇的青蛙棒 。这是一个健康的青蛙棒感光，在椭球区域呈现出强大的NADH的荧光。光线照射前有外段的最小荧光。光线照射后，由于维生素A的形成是有显着增加外段荧光
图5。鼠标杆与视黄醇 ，这是一个健康的鼠标杆感光，由于光线照射后形成维生素A的鼠标杆光感受器椭球区域不表现出强烈的荧光信号显着的外段荧光。
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Discussion
如果未取得健康孤立的细胞，但问题在于与隔离或视网膜的健康，或者其斩。通常情况下，取出后，眼睛的玻璃体前，视网膜随时升空色素上皮细胞。如果没有，尝试从外围眼罩开始剥离它关闭。如果它仍然是难以分开，一个可能性是，动物还没有足够的时间内，暗适应，或太亮了红灯。确保适当的暗适应的动物，和昏暗的红灯。在视网膜上的杆光感受器的存在，可以很容易地通过检查孤立的视网膜的颜色确定：切小块的视网膜，并将其转移到一个单独的培养皿中，然后可以根据房间的灯看。一块含杆光感受器的视网膜有一个鲜红的颜色（由于视紫红质）淡入迅速。无色片显示的视紫红质的情况下，因此杆光感受器。这可能是由于视网膜色素上皮细胞的分离不当或不健康的视网膜。在这种情况下，你应该确保动物的健康和他们适当的暗适应。如果一个健康的视网膜获得，但不是孤立的健康细胞，然后的问题是最有可能与斩波的。罚款砧板是至关重要的：如果斩波太粗，或视网膜脱胶，结果大多在视网膜件，而不是孤立的细胞。良好的砧板，通常会导致在一个“云”解决方案中的细胞。
单光感受器细胞的荧光成像技术可以使用，如NADH，FAD或维生素A的内源性细胞的荧光基团，以及对不同因素的敏感的荧光染料，探针实时广泛的生理过程。该方法可应用于许多不同的物种，包括两栖动物，如蝾螈（Ambystoma tigrinum）17,18和青蛙（蛙蚊）20，蜥蜴（壁虎壁虎）21，鱼（斑马鱼，斑马鱼）11，和鼠标（ MUS musculus）的22。该方法扩展到老鼠细胞，使不同类型的转基因动物的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持内授予EY014850。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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