הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
האיבר של קורטי יונקים הוא פסיפס הסלולר הורה מאוד של שיער mechanosensory ותאים תומכים nonsensory
(הנסקרת ב 1,2). ויזואליזציה של הפסיפס הזה הסלולר לעתים קרובות מחייב את האיבר של קורטי הוא בחתך רוחב. בפרט, עמוד nonsensory ותאי "Deiters, שאת הגרעינים נמצאים basally ביחס לתאי שיער, לא יכול להיות דמיינו מבלי לחצות חתך את האיבר של קורטי. עם זאת, cytoarchitecture עדין של האיבר של קורטי היונקים, כולל תהליכים cytoplasmic קנס של העמוד ותאי "Deiters, קשה לשמור על נהלים היסטולוגית שגרתיות כגון פרפין cryo-חתך, אשר תואם תקן טכניקות צביעה immunohistochemical.
הנה אני מתארת תהליך פשוט וחזק המורכב vibratome חתך של שבלול, מכתים immunohistochemical מהסעיפים האלה vibratome בהר שלמה, ואחריו מיקרוסקופיה confocal. הליך זה כבר בשימוש נרחב לניתוח immunhistochemical של איברים מרובים, לרבות ניצן העכבר איבר, בטן דג הזברה, כבד, לבלב, לב (ראו 3-6 דוגמאות נבחרות). בנוסף, הליך זה היה sucessful הדמיה והן quantitificaton של מספר העמוד תא באיברים מוטציה ובקרה של קורטי בשני עוברי עכברים בוגרים ו 7. שיטה זו, עם זאת, כרגע לא בשימוש נרחב לבחון את איבר יונקים של קורטי. הפוטנציאל עבור הליך זה הן לספק שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של איבר הבוגרת של קורטי לאפשר כימות של סוגי תאים שונים מתואר.
פרוטוקול
1. בידוד קיבוע פנימי של האוזניים
- ניתוח של דפוסים הסלולר האיבר של קורטי, להרדים כראוי מבוים עוברים או מבוגרים.
- לנתח את הקפסולה otic, המכיל את האוזן הפנימית קרומי. בשנת העכבר, זה יכול להיעשות בקלות על העוברים על העובר (ה) ביום 14.5 ומעלה, שבה E0.5 הוא היום שבו תקע הנרתיק זוהה. Dissection של הקפסולה otic נעשה לראשונה על ידי עריפת ראש ופתיחת הגולגולת על קו האמצע. הסר המוח לחשוף כל אוזן (איור 1A). האוזניים הפנימי ניתן הפגיזו את מלקחיים באמצעות שלמים (כגון 1B דומון # 5, איור.). אם הדמיה האיבר של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההליך של חתך vibratome, ואחריו הדמיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מאפשר להדמיה של האיבר של קורטי עם נזק לרקמות מינימלית. ברור confocal תמונות שנלקחו האזורים הפנימיים בסעיף vibratome להראות שימור מעולה של מורפולוגיה תאית מוגבל רק על ידי חפצים קיבעון. תמונות שצולמו Confocal קרוב לשני משטחים לחתוך קטע vibratome לעיתים קשה להבדיל בין תמונות מאזורים פנימיים, למרות השיבושים הסלולר מפעם לפעם, כמו הפסקות סיומות cytoplasmic של תאים עמוד נצפו (לא מוצג). גישה זו היא פשוטה, ואת הפריטים הציוד ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית הספר לרפואה של ויסקונסין IACUC.
תודות
המחבר מבקש להודות השימוש המחקר Core הילדים הדמיה המכון מיקרוסקופיה confocal ד"ר ג'אנג ג'יאן על ההצעה לעלות חלקים באמצעות חרוזים agarose. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH DC010387.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| לייקה VT1000S רטט Blade Microtome | לייקה | ||
| Zeiss LSM510 סריקת לייזר confocal מיקרוסקופ | Zeiss | ||
| סטודנט דומון # 5 מלקחיים | המדע כלים פיין | 91150-20 | |
| טמפ 'התכה נמוכה ultrapure agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| פיל-A-Way הטבעה עובש | Polysciences | 18986 או 18646A | |
| שור בסרום אלבומין | ג'קסון ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| עיזים סרום | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| אלקסה פלואוריד 568 עיזים נגד ארנב IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 דילול |
| Vectashield | וקטור Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| ואקום גריז | דיג | S41718 | |
| Affi-Gel ג'ל כחול | Bio-Rad | 153-7301 |
מקורות
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
