Chromatin पृष्ठीय रूट ganglia ऊतक से axonal चोट के बाद immunoprecipitation
Summary
हम axonal चोट के बाद पृष्ठीय रूट ganglia ऊतक से chromatin immunoprecipitation के लिए एक विधि उपस्थित थे. दृष्टिकोण के विशिष्ट प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों और दोनों परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में घायल axons के उत्थान के लिए histone और महत्वपूर्ण डीएनए की epigenetic संशोधन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) में axons जबकि परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) में उन चोट के बाद एक सीमित हद तक (टेंग एट अल., 2006) को पुनर्जीवित करते नहीं पुनर्जीवित करते हैं . यह मान्यता है कि transcriptional neurite और axonal परिणाम के लिए आवश्यक कार्यक्रमों पीएन (Makwana एट अल., 2005) में चोट पर फिर सक्रिय कर रहे हैं. हालांकि vivo में neuronal जीन विनियमन का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध उपकरणों सीमित है और अक्सर चुनौतीपूर्ण हैं.
पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) एक उत्कृष्ट चोट मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं क्योंकि दोनों सीएनएस और पीएन एक बंटवारा ही सोम से उद्भव अक्षतंतु द्वारा innervated हैं. ganglia सेल शरीर में जहां सभी transcriptional घटनाओं होते की एक असतत संग्रह का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस तरह transcriptional गतिविधि का एक स्पष्ट रूप से परिभाषित क्षेत्र है कि आसानी से और reproducibly जानवर से हटाया जा सकता है प्रदान करते हैं. पीएन (जैसे sciatic तंत्रिका), जहां axonal उत्थान होती है में तंत्रिका तंतुओं की चोट transcriptional कार्यक्रमों का एक सेट है कि CNS में एक इसी तरह की चोट के जवाब उन जहां उत्थान जगह (जैसे रीढ़ की हड्डी नहीं ले करता है से अलग कर रहे हैं प्रकट करना चाहिए ). प्रतिलेखन कारक बंधनकारी, histone और डीएनए की चोट से या तो पीएन या सीएनएस के परिणामस्वरूप संशोधन के लिए साइटें chromatin immunoprecipitation (चिप) का उपयोग लक्षण वर्णन किया जा सकता है.
यहाँ, हम एक चिप axonal चोट के बाद तय माउस DRG ऊतक का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन. इस शक्तिशाली संयोजन समर्थक उत्थान chromatin axonal उत्थान को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक वातावरण निस्र्पक के लिए एक साधन प्रदान करता है.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल के लिए सीधे axonal चोट के बाद वयस्क तंत्रिका तंत्र में axonal उत्थान के दौरान chromatin वातावरण के बारे में पूछने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. यह chromatin immunoprecipitation साथ DRG चोट मॉडल शामिल transcriptional और epigenetic चोट के बाद ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Andrea Tedeschi ठीक धुन चिप के लिए शर्तों के लिए अपने योगदान के लिए प्रयोगशाला और Ricco Lindner में प्रारंभिक चिप प्रयोगों की स्थापना में मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. इस काम Hertie फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था, फॉर्च्यून अनुदान, विश्वविद्यालय Tuebingen, और DFG डि 1497/1-1 अनुदान (सभी सिमोन डि Giovanni के लिए दी गई).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
References
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