पहचान और माउस Erythroid progenitors के विश्लेषण CD71/TER119 परख फ्लो - cytometric का उपयोग
Summary
प्रवाह cytometric पहचान और भेदभाव मंच विशिष्ट murine erythroid progenitors और हौसले से काटा माउस अस्थि मज्जा, प्लीहा या भ्रूण जिगर में सीधे व्यापारियों, आणविक विश्लेषण के लिए एक तरीका है. परख सेल सतह CD71 मार्करों, Ter119, और सेल के आकार पर निर्भर करता है.
Abstract
erythropoiesis के अध्ययन के लिए समझने के लिए कैसे लाल कोशिकाओं को पहले hematopoietic और erythroid progenitors से गठन कर रहे हैं करना है. विशेष रूप से, लाल कोशिका गठन की दर हार्मोन (ईपीओ) erythropoietin, जिसका संश्लेषण ऊतक hypoxia के द्वारा ट्रिगर द्वारा नियंत्रित किया जाता है. ईपीओ में एक तेजी से वृद्धि में पर्याप्त ऊतक oxygenation परिणाम erythropoietic दर में वृद्धि ड्राइविंग के लिए एक खतरा, एक प्रक्रिया erythropoietic तनाव प्रतिक्रिया के रूप में जाना जाता है. लाल कोशिकाओं परिसंचारी की संख्या में वृद्धि हुई है जिसके परिणामस्वरूप ऊतक ऑक्सीजन वितरण में सुधार. एक कुशल erythropoietic तनाव प्रतिक्रिया इसलिए अस्तित्व और उच्च ऊंचाई, रक्ताल्पता, नकसीर, कीमोथेरेपी या स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के रूप में शारीरिक और रोग की स्थिति से वसूली के लिए महत्वपूर्ण है.
माउस erythropoiesis और अपने तनाव प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल है. निश्चित (वयस्क प्रकार) माउस erythropoiesis नवजात तिल्ली में, और वयस्क तिल्ली और अस्थि मज्जा में भ्रूण 12.5 और 15.5 दिनों के बीच भ्रूण जिगर में जगह लेता है. ऊतक में erythroid progenitors की पहचान की शास्त्रीय तरीकों इन कोशिकाओं की क्षमता लाल सेल कालोनियों को जन्म दे जब ईपीओ युक्त अर्द्ध ठोस मीडिया में चढ़ाया पर भरोसा करते हैं. उनके erythroid अग्रदूत संतान रूपात्मक मापदंड के आधार पर पहचाने जाते हैं. न तो इन तरीकों के शास्त्रीय भेदभाव मंच विशेष अध्ययन के लिए आणविक erythroid कोशिकाओं की बड़ी संख्या के लिए उपयोग की अनुमति देते हैं. यहाँ हम पहचान और अध्ययन हौसले से पृथक माउस ऊतक के संदर्भ में सीधे भेदभाव मंच विशिष्ट erythroid progenitors और व्यापारियों, एक प्रवाह cytometric विधि प्रस्तुत करते हैं. परख CD71 सेल सतह मार्कर, Ter119 पर निर्भर करता है, और प्रवाह cytometric 'आगे तितर बितर' पैरामीटर पर है, जो कक्ष आकार के एक समारोह है. CD71/Ter119 परख के उनके vivo में erythropoietic तनाव के जवाब के दौरान erythroid progenitors अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कम ऑक्सीजन की स्थिति में खून की कमी चूहों या चूहों में रखे. यह भी आनुवंशिक रूप से संशोधित वयस्क चूहों या भ्रूण के ऊतकों में सीधे erythroid progenitors का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रम में करने के लिए संशोधित erythropoiesis में आणविक मार्ग की विशिष्ट भूमिका का आकलन.
Protocol
Discussion
प्रवाह – cytometric पद्धति किसी भी सेलुलर समारोह है कि एक प्रतिदीप्ति संयुग्मित विशिष्ट एंटीबॉडी या कोशिका की सतह मार्करों, प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेल अस्तित्व, सेल संकेतन का उपयोग phospho विशिष्ट 3 एंटीबॉडी और …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम UMass प्रवाह cytometry कोर धन्यवाद: रिचर्ड Konz, टेड Giehl, बारबरा Gosselin, Yuehua गुजरात और छलनी Krupoch. यह काम NIH / NHLBI HL084168 RO1 (एमएस) और NIH T32 +१३०८०७ सीए (JRS) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. कोर मधुमेह इन्डोकिरनोलाजी अनुसंधान केंद्र अनुदान DK32520 द्वारा समर्थित संसाधनों का भी इस्तेमाल किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
References
- Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
