Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay
Summary
Een flow-cytometrische methode voor de identificatie en moleculaire analyse van differentiatie-fase-specifieke muriene erytroïde voorlopers en precursoren, direct in vers geoogste muis beenmerg, milt of foetale lever. De test is gebaseerd op het celoppervlak markers CD71, Ter119, en de celgrootte.
Abstract
De studie van de erytropoëse wil om te begrijpen hoe rode cellen worden gevormd uit eerdere hematopoëtische en erythroid voorlopers. In het bijzonder, is de snelheid van de rode bloedcellen de vorming gereguleerd door het hormoon erytropoëtine (EPO), waarvan de synthese wordt geactiveerd door weefselhypoxie. Een bedreiging voor een adequate zuurstofvoorziening van de weefsels resulteert in een snelle toename van EPO, het rijden een verhoging van de erytropoëtische tarief, een proces dat bekend staat als de erytropoëtische stress respons. De daaruit voortvloeiende toename van het aantal circulerende rode bloedcellen verbetert weefsel zuurstof levering. Een efficiënte erytropoëtische reactie op stress is dan ook van cruciaal belang voor het overleven en herstel van fysiologische en pathologische omstandigheden, zoals grote hoogte, bloedarmoede, bloedingen, chemotherapie of stamceltransplantatie.
De muis is een belangrijke model voor de studie van de erytropoëse en de reactie op stress. Muis definitieve (volwassen-type) erytropoëse vindt plaats in de foetale lever tussen embryonale dag 12,5 en 15,5, in de neonatale milt, en bij volwassen milt en beenmerg. Klassieke methoden voor het identificeren erytroïde voorlopercellen in het weefsel vertrouwen op het vermogen van deze cellen om aanleiding te geven tot rode bloedcellen kolonies toen bedekt met Epo-bevattende semi-vaste media. Hun erytroïde voorloper nakomelingen zijn geïdentificeerd op basis van morfologische criteria. Geen van deze klassieke methoden toegang tot een groot aantal van differentiatie-fase-specifieke erythroïde cellen voor moleculair onderzoek. Hier presenteren wij een flow-cytometrische methode voor het identificeren en bestuderen van differentiatie-fase-specifieke erytroïde voorlopers en voorlopers, direct in de context van vers geïsoleerde muis weefsel. De test is gebaseerd op het celoppervlak markers CD71, Ter119, en op de flow-cytometrische 'forward-scatter' parameter, die een functie is van de celgrootte. De CD71/Ter119 assay kan worden gebruikt om erythroïde voorouders bestuderen tijdens hun reactie op erytropoëtine stress in vivo, bijvoorbeeld bij anemische muizen of muizen ondergebracht in lage zuurstofgehalte. Het kan ook worden gebruikt om erythroïde voorouders studie direct in de weefsels van genetisch gemodificeerde volwassen muizen of embryo's, om de specifieke rol van de gewijzigde moleculaire route in erytropoëse te beoordelen.
Protocol
Discussion
De flow-cytometrische methodiek maakt gelijktijdig onderzoek van alle cellulaire functie die kunnen worden gedetecteerd met een fluorescentie-geconjugeerd specifiek antilichaam of ligand, waaronder celoppervlaktemerkers, eiwitexpressie, overleving van de cel signaleren met behulp van fosfo-specifieke antilichamen 3 en celcyclus status. Deze metingen kunnen worden gedaan in elk van een aantal van de differentiatie-fase specifieke subgroepen, in het kader van vers geïsoleerde erytropoëtische weefsel. Deze met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de UMass flow cytometrie kern: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu en Tammy Krupoch. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) en NIH CA T32-130807 (JRS). Core middelen gesteund door het Diabetes Endocrinologie Research Center te verlenen DK32520 werden ook gebruikt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
References
- Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
