התמרה של תאים אנושיים עם Lentivirus פולימר-ומורכבת Ecotropic עבור Enhanced biosafety

Summary

Lentiviruses הם כלי מחקר חשוב לחקר תפקוד הגנים, אולם החוקרים מומלץ להימנע הייצור של קידוד lentivirus pantropic ידוע או אונקוגנים חשד. כחלופה, אנו מציגים פרוטוקול בטוחה יותר לשימוש lentivirus ecotropic על תאים אנושיים שונה לבטא את mSlc7a1 קולטן ecotropic.

Abstract

גזע סרטניים ביולוגיה מחקרים תא לעיתים קרובות דורשים התמרה ויראלית של תאים אנושיים עם אונקוגנים ידועים או חשודים, העלאת בעיות בטיחות מרכזי אנשי המעבדה. Lentiviruses Pantropic, כגון נפוץ VSV-G pseudotype, הם כלי רב ערך ללימוד פונקציה גן משום שהם יכולים transduce סוגי תאים רבים, כולל תאים שאינם מתחלקים. עם זאת, החוקרים עשויים לרצות להימנע ייצור צנטריפוגה של וירוסים pantropic קידוד אונקוגנים עקב גבוה טיפול biosafety דרישות לרמה בעיות בטיחות. אונקוגנים מספר חזק, כולל c-myc ו SV40 אנטיגן T גדול, ידועים כדי לשפר את הייצור של המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSC). כל שאר ידוע iPSC וישכנע שינויים גנטיים (OCT4, Sox2, KLF4, Nanog, LIN28, ואובדן של תפקוד p53) יש גם קישורים סרטן, מה שהופך אותם דאגה בטיחות גבוהה יחסית גם כן.

בעוד אלה הקשורים לסרטן וירוסים מועילים ללמוד תכנות מחדש הסלולר pluripotency, יש להשתמש בהן בבטחה. כדי לטפל בבעיות אלה biosafety, אנחנו מדגימים שיטה התמרה של תאים אנושיים עם lentivirus ecotropic, עם דגש נוסף על עלות מופחתת וטיפול נוח. יש לנו המיוצר lentivirus ecotropic עם כייל גבוה מספיק כדי transduce יותר מ 90% של קולטן להביע תאים אנושיים שנחשפו לנגיף, תוקף את היעילות של גישה זו.

Lentivirus מרוכזת לעתים קרובות על ידי ultracentrifugation, אך תהליך זה לוקח כמה שעות יכול לייצר אירוסולים זיהומיות לחוקרים ביו האדם. כחלופה, חלקיקים נגיפיים יכול להיות משקעים בצורה בטוחה יותר על ידי תאים complexation עם סולפט כונדרואיטין ו polybrene (CS / PB). טכניקה זו מגבירה את titer ויראלי פונקציונלי עד פי 3 בתאים ביציבות לבטא קולטן רטרווירוס Murine, עם הזמן הוסיף העלות זניחה. התמרה של fibroblasts עורי האנושי (HDFS) היא משופרת מקסימאלי באמצעות CS / PB ריכוזים של פי כ -4 נמוך יותר משווי אופטימלי שדווח קודם לכן על שורות תאים סרטניים, טוען כי ריכוז הפולימר צריך להיות טיטרציה עבור סוג תא היעד של עניין. לפיכך, אנו מתארים את השימוש methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ברומיד (MTT) כדי assay רעילות פולימר בסוג התא החדש. אנו צופים הכדאיות המקבילה של HDFS לאחר התמרה ויראלית או באמצעות complexation פולימר או את המינון הסטנדרטי של polybrene (PB, 6 מיקרוגרם / מ"ל), המעיד רעילות חריפה מינימלית.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש lentivirus ecotropic עבור overexpression של אונקוגנים בתאים אנושיים, הפחתת סיכונים biosafety והגדלת שיעור התמרה. אנחנו גם מדגימים את השימוש complexation פולימר כדי לשפר התמרה תוך הימנעות אירוסול יוצרי צנטריפוגה של חלקיקים נגיפיים.

Protocol

1. Lentivirus production, harvest, and freezing Consult your institutional safety official before beginning this protocol, and follow their recommended safety guidelines. Day 1. Start with healthy, rapidly growing 293T cells to produce virus. Plate the cells at 5 x 106 cells per 10 cm plate. Use antibiotic-free 293T medium (high-glucose DMEM with 10% FBS and 4 mM L-glutamine) for virus production. Day 2. In the late afternoon, transfect 293T cells as follows (numbers given are for one 10 cm plate). Let all reagents warm up to room temperature. Pipette 375 μl OptiMEM into a microcentrifuge tube, then add 25 μl Fugene HD. Do not allow undiluted Fugene to contact the surface of the tube. In a microcentrifuge tube, mix: 5 μg transfer plasmid (Slc7a1, target vector, or fluorescent control vector) 3.75 μg packaging plasmid (pCMV-dR8.91 or psPax2) 1.25 μg envelope plasmid (pMD2.G for pantropic, pHCMV-EcoEnv for ecotropic) serum-free OptiMEM to 100 μl Combine the two tubes and incubate the mixture 20-30 minutes at room temperature. Change the medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Add the Fugene/plasmid mix drop-wise to the plate and incubate overnight at 37°C, 5% CO2. Day 3. Change medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Be gentle, because 293T cells adhere only loosely and can slough off by media pipetted too forcefully onto the monolayer. Incubate for two days in a humidified incubator for virus production. Day 5. Harvest virus and filter with a 0.45 mm low protein binding filter. Use immediately or dispense into single-use aliquots and freeze at -80°C. Frozen pantropic and ecotropic virus should be re-titered after it has been stored for six months and one month, respectively. Titer the virus as follows, using cells that are relatively amenable to transduction. Transduce cells with fluorescent control virus overnight using serial dilutions (e.g. 1:10, 1:100, 1:1000) in fresh medium with 6 μg/ml PB. Change to fresh medium the next day. Allow the cells two days after transduction to begin expressing the fluorescent protein, then determine the fraction of transduced cells by FACS. Calculate the titer in transforming units (TU) per ml, based on dilutions that yield < 15% transduction to minimize multiple transduction events. 2. Transduction of human target cells with murine retrovirus receptor Slc7a1 Select a multiplicity of infection (MOI) = 2 to ensure that most cells will be transduced. For target cells that are resistant to transduction such as HDFs, a higher MOI will be required; we dilute the viral supernatant only 1:2 to achieve transduction of a majority of the cells. Transduce target cells overnight with viral supernatant diluted in fresh culture medium with 6 μg/ml PB, which increases transduction by enhancing electrostatic interaction between the virus and target cell.1 Ideally one should use a minimal volume of virus, such as 1 ml for a 35 mm plate, because diffusion is a limiting factor in transduction efficiency. Culture cells for at least 48 hours after removing virus before transducing them with ecotropic virus, in order to ensure sufficient expression of the Slc7a1 receptor. (Optional) It is possible to use blasticidin to select for stably transduced cells expressing Slc7a1, if desired. A blasticidin kill curve should be generated in advance to determine the lowest effective concentration, generally between 2 – 10 μg/ml, that kills all untransduced target cells in 7 days. About 2 days after removing the Slc7a1 virus, switch the transduced cells to medium containing blasticidin. Culture the cells in blasticidin-containing medium for 7 days, at which point all remaining cells will stably express the retrovirus receptor at which point they can be transduced with ecotropic virus as well as banked for future use as a stable Slc7a1-expressing line. 3. Polymer complex titration to determine toxicity Day 1. Plate cells at 5000 cells/well in a 96-well plate, allowing at least triplicate wells for each experimental group. Include untransduced cells in complete medium to provide a baseline value for healthy cells, as well as samples consisting of cells in serum-free medium to induce growth arrest as a control. In parallel, plate cells in an appropriate format (such as a 24-well plate) for microscopic or FACS-based analysis of transduction efficiency in each experimental condition. Day 2. Transduce cells in plates set up for both the MTT and FACS analyses with virus encoding GFP, at an MOI of 0.5 to transduce ~40% of target cells. Test varied concentrations of CS/PB (e.g. 50, 100, 200, 400, 600, and 800 mg/ml of each component), as well as 6 μg/ml PB, to determine optimal amounts. Generate polymer complexes as described in Part 4, below. Day 3. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. Return the plates to a humidified incubator. Day 5. Analyze FACS plate to determine the transduction efficiency with each polymer concentration. Day 6. Remove the medium from all wells of the MTT plate and replace with 100 μl MTT solution (1 mg/ml MTT in complete medium). Culture for three hours in a humidified incubator to allow MTT to be reduced in the mitochondria of metabolically active cells. Remove MTT solution and replace with 200 ml MTT solvent (0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630 in isopropanol). Incubate for two hours at room temperature or until all of the purple MTT formazan precipitate is dissolved. Read the absorbance on a microplate reader at 570 nm, subtracting the background reading at 690 nm. Select the optimal polymer concentration that produces maximum enhancement of transduction, as determined by FACS, with minimal effect on metabolic activity, as determined by MTT. For HDFs, we selected 100 μg/ml CS/PB based on the data shown in the Representative Results, below. 4. Ecotropic transduction with polymer complexation Prepare sterile-filtered stock solutions of PB and chondroitin sulfate at 20 mg/ml in water. Aliquot and store at -20°C. Pipette viral supernatant into a microcentrifuge tube and dilute to the desired final concentration (e.g. MOI of 2) with fresh culture medium. Add equal volumes of PB and chondroitin sulfate (concentrations determined in step 3 above) in succession, flicking the tube to mix after each addition. The viral mixture will immediately become cloudy as precipitates form. Incubate the viral mixture at room temperature for 5 minutes to allow complex formation. Remove media from the receptor-expressing target cells, replace with the viral mix, and incubate overnight at 37°C, 5% CO2. After removing the viral mix, wash the surface of the cells twice with PBS to aid in removing viral complexes. Complete removal is not necessary; we have observed no adverse effects on cell health from residual polymer complexes. 5. Verifying specificity of ecotropic transduction When producing ecotropic virus for the first time, it is prudent from a safety perspective to verify that the virus is unable to transduce unmodified human cells. Transduce human cells with ecotropic lentivirus at relatively high concentration (only a 1 to 2-fold dilution of viral supernatant in fresh medium) overnight with 6 μg/ml PB or optimized CS/PB concentration. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. After incubating cells for 2 days, validate transgene expression by FACS using fluorescent vectors and/or by RT-PCR with transgene-specific primers. 6. Representative results: Fig. 1A shows the lentivirus production process, and Fig. 1B shows transduction of human cells with ecotropic lentivirus, including pre-transduction with murine retrovirus receptor Slc7a1. For titering virus, we use a human rhabdomyosarcoma cell line stably transduced with Slc7a1 (Slc-hRMS). When using fluorescent control vectors to monitor transduction efficiency, we routinely achieve > 90% transduction efficiency of Slc-hRMS with ecotropic virus, as shown in Fig. 2A and 2B. Transduction rates of HDFs are generally lower because the cells have not been blasticidin-selected for receptor expression (Fig. 2C). Titers of ecotropic lentivirus are generally 10-20% of VSV-pseudotyped virus when measured on Slc-hRMS (Fig. 2D). One freeze-thaw cycle reduces titer of ecotropic virus by 16 – 3%, equal to titer loss during a single freeze-thaw cycle of VSV-pseudotyped virus (p > 0.05). Contrary to previous reports,2 we observe no positive effect on virus titer from flash freezing in dry ice. Rather, we achieve higher post-thaw titers of either pseudotype by simply placing tubes of virus into a -80°C freezer (data not shown). The MTT viability assay allows sensitive detection of growth arrest in target cells. Transduction with virus plus concentrations of CS/PB up to 800 μg/ml has no effect on HDF metabolism (Fig. 3A). Exposure to CS/PB without virus also has no toxic effect on cells (data not shown). FACS analysis of HDFs transduced with virus plus various concentrations of CS/PB shows enhancement of transduction compared to PB alone (Fig. 3B). The maximum enhancement occurs at 100 μg/ml CS/PB (Fig. 3C), several-fold lower than previously reported values.3 Thus, it is important to optimize conditions for any given target cell type. Complexation with CS/PB enhances the observed titer roughly 3-fold in Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0.01). In practice, this yields a greater effect on transduction efficiency at low virus concentrations than at higher concentrations (Fig. 4B), which is most likely due to multiply transduced cells and receptor saturation at higher virus concentrations. Transduction with ecotropic virus is specific for cells expressing murine retrovirus receptor. When transducing unmodified human cells with ecotropic virus, we have not observed fluorescence greater than the untransduced background whether using PB or CS/PB, as shown in Fig. 5A. Microscopically, HDFs show no transduction in the absence of receptor (Fig. 5B) while pre-transduction with receptor results in fluorescent cells (Fig. 5C). Figure 1. Schematic view of (A) the virus production process and (B) transduction of human cells with murine retrovirus receptor followed by ecotropic lentivirus. Figure 2. High-efficiency transduction of human cells with ecotropic lentivirus encoding GFP. Cells were pre-transduced with murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) Human rhabdomyosarcoma cell line blasticidin-selected for Slc7a1 (Slc-hRMS), transduced (blue) or untransduced (pink) with GFP. (B) Fluorescent micrograph of ecotropic-transduced Slc-hRMS (4X). (C) HDFs transduced (blue) and untransduced (pink) with ecotropic GFP lentivirus; cells were transduced with Slc7a1 two days prior to ecotropic transduction. (D) Titer of VSV-G pseudotyped and ecotropic lentivirus, measured on Slc-hRMS. Figure 3. Optimizing chondroitin sulfate/polybrene (CS/PB) concentrations in human dermal fibroblasts. (A) Viability of HDFs measured by MTT assay after transduction in the presence of PB only or with varied concentrations of CS/PB. (B) Enhancement of transduction efficiency in HDFs by different concentrations of CS/PB, measured by FACS. (C) Quantification of transduction enhancement, showing that maximum transduction occurs at 100 μg/ml CS/PB. Figure 4. Effect of 400 μg/ml CS/PB on transduction of Slc-hRMS with ecotropic lentivirus. (A) Titer enhancement, and (B) fold change in transduction rate compared to 6 μg/ml polybrene alone. Figure 5. Lack of ecotropic transduction of HDFs in the absence of murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) FACS plot of BJ human fibroblasts, untransduced (pink) or transduced (blue) with ecotropic GFP lentivirus in both cases in the absence of receptor Slc7a1. BJ human fibroblasts transduced with ecotropic GFP lentivirus, without (B) and with (C) pre-transduction with receptor Slc7a1 (4X).

Discussion

רקומביננטי gammaretrovirus ecotropic מבוסס על וירוס Murine לוקמיה Moloney (MLV) ו mSlc7a1 הקולטן שלה נלמדים היטב הנפוצה, לאחר ששימש במשך 20 שנים כדי לספק transgenes לתאי Murine. Gammaretrovirus Ecotropic שימש גם ולאחרונה לספק אונקוגנים לתאי האדם;. בהקשר של תכנות מחדש הסלולר, השימוש mSlc7a1 להימנע דור של הנגיף amphotropic מחסה אונקוגנים האנושי מבוסס היטב ^4,5 עם זאת, lentivirus מספק יתרונות משמעותיים על פני gammaretrovirus ב transducing אוכלוסיות תאים עקשן, ⁶ תאים ראשוניים כולל שלעתים קרובות מטרות רצוי תכנות מחדש, משום מורכבות lentiviral מראש השילוב מאפשר התמרה של אי חלוקת התאים. ⁷

Lentiviruses הופקו עשרות pseudotypes שונים, לרבות MLV, בניסיון לשנות כמיהות וירוס, רעילות, ונכסים אחרים. ⁸ MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic שימש transduce בתאי עכבר, ⁹ אך לעתים רחוקות נעשה שימוש על תאים אנושיים . ¹⁰ לפיכך, אנו מציעים את השימוש lentivirus MLV-pseudotyped ecotropic ככלי עלות בטוח, יעיל, היעילה ביותר, כדי לספק אונקוגנים ידועים או חשודים, כולל תכנות מחדש גורמים הסלולר, על תאים אנושיים.

זה קריטי לציין כי פרוטוקול זה לא לגמרי מבטל את הצורך לייצר ולהשתמש lentivirus pantropic, אלא פרוטוקול זה מפריד בין אונקוגן (ים) מן הנגיף pantropic, בידוד חוקרים פוטנציאל עצמית חיסון סרטן הקשורים וירוסים. MSlc7a1 חלבון hSlc7a1 homologue האנושי שלה באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף מובילי חומצת אמינו עם tumorigenicity לא ידוע או היכולת להעניק יתרון צמיחה סלקטיבית על תאים הנמען, ¹¹ mSlc7a1 קבלת סיכון נמוך יחסית עבור הכללתו וירוס amphotropic. זהו צעד נוסף עשוי להיות שימושי במיוחד במעבדות חסר וירוס ייעודי או מתקני תרבות רקמות רמת biosafety הנדרש.

במצבים מסוימים זה עשוי להיות אפשרי כדי לבטל לחלוטין את השימוש וירוס pantropic ידי transfecting Slc7a1 הפלסמיד ישירות לתוך התאים היעד, אולם תאים רבים זה יהיה שימושי מטרות של טכניקה זו גם עקשן transfection. כחלופה, את היכולת לבודד Slc7a1-transduced תאים על ידי בחירת blasticidin כלומר VSV-G lentivirus pseudotyped ניתן להשתמש פעם אחת כדי ליצור מלאי של קולטן להביע תאים, לאחר וירוס ecotropic ניתן להשתמש באופן שגרתי transduce תאים אלו עבור רבים ניסויים. חוקרים צריך תמיד לעקוב אחר הנחיות הבטיחות המוסדי שלהם לעבודה עם lentivirus, ללא קשר כמיהות שלה.

Titers של הנגיף ecotropic שהושגו עם פרוטוקול זה בינוני נמוך יותר מאשר וירוס VSV-pseudotyped, בדרך כלל 10-20% של כייל הנגיף pantropic, בהסכם עם מחקרים קודמים. ⁹ titers אלה נמדדו בתאים אנושיים ביציבות transduced עם Slc7a1, כך נמוך יותר titer שנצפה עבור וירוס ecotropic יכול להיות גם בגלל ביטוי מגוון של הגן לקולטן בתאי המטרה. עם זאת, titers ויראלי להשיג בפרוטוקול שלנו הם יותר מהדרוש עבור מרבית היישומים להוביל התמרה של רוב התאים, במקרים מסוימים> 90% של תאים.

צנטריפוגה מבוססי טכניקות משמשות להתרכז חלקיקים נגיפיים. עם זאת, צנטריפוגה דורש מספר שעות, מייצר אירוסולים זיהומיות, והוא יכול לגרום לאובדן משמעותי של חלקיקים נגיפיים. ¹² כחלופה, complexation עם CS / PB יכול לשמש כדי לשפר התמרה מבלי לשנות כמיהות ויראלי. ³ שיטה זו היא מהירה (5 דקות ) וזול (0.03 דולר וירוס 10 מ"ל), בעוד בערך tripling titer ציין. אין ציוד מיוחד או חומרים כימיים קניינית נדרשים, ואנחנו נצפתה רעילות חריפה לאחר חשיפה מינימלית של HDFS ל CS / PB, בהסכם עם העבודה הקודמת שורות תאים אחרים. ¹³ חסרון אחד הפוטנציאל של פרוטוקול זה הוא חלק מתחמי לעין מיקרוסקופית פולימר לדבוק התאים במשך כמה ימים בתרבות. אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי קומפלקסים אלה, ואילו לא רעיל בגלוי על התאים, עלולות להיות השפעות עדינות יותר על תהליכים תאיים.

כאן יש לנו תיאר מתודולוגיה בבטחה וביעילות transducing תאים אנושיים עם גורמים בשעור. גישה זו צריכה להיות תועלת גדולה לחוקרים ללמוד אונקוגנים ו ביולוגיה של התא גזע כולל בתאי iPS.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murine MLV receptor
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G envelope
pCMV-dR8.91	D. Trono lab14		Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic envelope
FUGW	Addgene	14883	GFP control plasmid
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Fisher	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021