Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton
Summary
Bacterioplancton ambientales se incuban con un modelo del carbono orgánico disuelto (COD) y un reactivo compuesto de ADN de etiquetado, bromodesoxiuridina (BrdU). Después, DOC-degradantes células se separan de la comunidad a granel en base a su elevada incorporación de BrdU utilizando fluorescencia clasificación de células activadas (FACS). Estas células son identificadas por los posteriores análisis molecular.
Abstract
Los microbios son los principales agentes de mediación de la degradación de muchos de carbono orgánico disuelto (COD) sustratos en los ambientes acuáticos. Sin embargo, la identificación de los taxones de bacterias que transforman las piscinas específicas de DOC en la naturaleza supone un reto técnico.
A continuación se describe un enfoque que las parejas bromodesoxiuridina (BrdU) incorporación, la fluorescencia de células activadas clasificación (FACS), y 16S ARNr de análisis basados en genes molecular que permite que la cultura independiente de la identificación de bacterioplancton capaces de degradar un compuesto DOC específicas en los ambientes acuáticos. Microcosmos por triplicado bacterioplancton están preparados para recibir tanto BrdU y un compuesto modelo DOC (DOC modificaciones), o sólo BrdU (sin adición de control). Sustitutos de BrdU las posiciones de la timidina en el ADN de nueva síntesis bacteriana y BrdU marcado de ADN puede ser fácilmente immunodetected 1,2. A través de una de 24 horas de incubación, bacterioplancton que son capaces de utilizar el compuesto añadido DOC se espera que se activan selectivamente, y por lo tanto, tienen mayores niveles de incorporación de BrdU (células HI) que no responde a las células en las enmiendas DOC y las células no- Además de los controles (bajo recuento de incorporación de BrdU, las células LI). Después de inmunodetección de fluorescencia, las células se distinguen HI y separadas físicamente de las células LI por clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) 3. Ordenado DOC-respuesta (células HI) se extraen de ADN y taxonómicamente identificados a través de 16S rRNA gen posterior análisis basados en PCR como, la construcción de la biblioteca y la secuencia de clon.
Protocol
Discussion
Nuestras parejas enfoque BrdU incorporación, FACS y análisis de 16S ADNr para permitir que las especies a nivel de identificación de bacterioplancton que metabolizan los componentes individuales de DOC en los ambientes acuáticos. El ensayo de incorporación de BrdU etiquetas de las células bacterianas sobre la base de las actividades metabólicas, lo que permite el análisis sólo en las bacterias activas y por lo tanto no incluye a las células inactivas. En nuestro enfoque, la incorporación de BrdU se encuentra …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación de este proyecto fue proporcionado por la National Science subvenciones OCE1029607 Foundation (XM) y MCB0702125 (de MAM) y Gordon y Betty Moore Foundation (de MAM).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
References
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