الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة
Summary
نحن تصف طريقة لعملية وشاشة الميدانية التي تم جمعها. البعوض لمجموعة متنوعة من الفيروسات من خلال فحص خلايا فيرو الثقافة من خلال استخدام هذه التقنية ، وقد اكتشفنا 9 فيروسات مختلفة من الأسر التصنيفية 4 في البعوض التي تم جمعها في ولاية كونيتيكت.
Abstract
أنواع البعوض أن تنقل عددا من الفيروسات متميزة بما في ذلك مسببات الأمراض البشرية الهامة مثل فيروس غرب النيل ، وفيروس حمى الضنك ، وفيروس chickungunya. وقد كثفت العديد من هذه الفيروسات في نطاقاتها المتوطنة وتوسيعها لمناطق جديدة ، مما يستدعي المراقبة والسيطرة الفعالة برامج للرد على هذه التهديدات. استراتيجية واحدة لمراقبة نشاط فيروس ينطوي على جمع أعداد كبيرة من البعوض من المواقع الموبوءة واختبارها للعدوى الفيروسية. في هذه المقالة ، ونحن تصف كيفية التعامل معها ، والعملية ، والشاشة التي تم جمعها ميدانيا البعوض عن الفيروسات المعدية التي فيرو الخلية مقايسة الثقافة. يتم فرز حسب الموقع البعوض وأنواع الشرك ، وتجميعها في أحواض تحتوي على ≤ 50 فردا. والمتجانس العينات المجمعة مخزنة في المياه المالحة باستخدام خلاط ، مطحنة ، وتحصين المرحلة المائية متكدسة على الثقافات الخلية فيرو (استنساخ E6). ويتم رصد مزارع الخلايا لتأثير الاعتلال الخلوي من الأيام المحددة 3-7 بعد التلقيح وأي فيروسات نمت في الثقافة الخلية المقايسات التشخيصية المناسبة. باستخدام هذا النهج ، ونحن عزل 9 فيروسات مختلفة من البعوض التي تم جمعها في ولاية كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وبين هؤلاء ، ومن المعروف أن تسبب المرض 5 الإنسان. ثلاثة من هذه الفيروسات (فيروس غرب النيل ، وفيروس بوتوسي ، ولوس انجليس لفيروس كروس) تمثل سجلات جديدة لأمريكا الشمالية أو منطقة نيو إنجلاند منذ عام 1999. القدرة على الكشف عن تنوع واسع من الفيروسات أمر بالغ الأهمية لرصد كل من أنشأ والفيروسات الناشئة حديثا في أسراب البعوض.
Protocol
Discussion
فيرو مقايسة خلية ثقافة بمثابة وسيلة فعالة للبعوض الشاشة الميدانية التي تم جمعها لمجموعة متنوعة من الفيروسات. هذا يتناقض مع الأساليب الجزيئية التي تستهدف على وجه التحديد واحد أو عدد قليل من الفيروسات الفائدة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن فيرو مقايسة ثقافة الخلية بنفس الق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بامتنان بالمساهمات الهامة من الدكاترة. جون أندرسون ، واندرو شيرلي Tirrell الرئيسية لهذه الدراسة. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (U50/CCU116806-01-1) وزارة الزراعة الأمريكية (58-6615-1-218 ، CONH00768 وCONH00773).
Materials
| Name of reagent/ equipment | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Fetal bovine serum | Gibco – Invitrogen | 16140 |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco – Invitrogen | 15240 |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | Gibco – Invitrogen | 25080 |
| L-Glutamine 200mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | Gibco – Invitrogen | 11700 |
| 10X Dulbecco’s PBS | Gibco – Invitrogen | 14080 |
| Trypsin-EDTA | Gibco – Invitrogen | 15400 |
| Rabbit serum | Gibco – Invitrogen | 16120 |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353112 |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353108 |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper’s hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. . International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).
