测量单个活细胞中的mRNA转录的动力学
Summary
在活细胞中的特定基因上RNA聚合酶II转录的动力学测量。感兴趣的基因转录的mRNA荧光标记，并使用荧光漂白后（FRAP）在体内转录伸长动力学得到恢复。
Abstract
RNA聚合酶II（聚合酶II）的转录活性，是一个动态的过程， 因此测量在体内的转录过程中的动力学的重要性。聚合酶II动力学测量，利用生化或分子生物学方法。1-3近年来发展的新的可视化方法，它已成为可以遵循的转录发生在单个活细胞的实时4此中，我们介绍了如何执行在活细胞中特定基因的聚合酶II伸长动力学分析，5，6使用的细胞系，其中荧光标记一个特定的基因位点（DNA）的，其mRNA的产品，和最终的蛋白产物可在体内观察，它可以检测到感兴趣的基因转录的mRNA的实际，7，8的mRNA荧光标记使用标记的mRNA在体内，mRNA转录的3'UTR含有24 MS2的茎环MS2的系统重复，提供YFP – MS2外壳蛋白标签的mRNA转录的高度特异性结合位点（ 九 ）监测转录的动力学我们使用漂白（FRAP）方法后，荧光恢复。通过在转录现场漂白新生成绩单YFP – MS2的标签，然后按照这种信号随时间的恢复，我们取得新的mRNA的合成率。，换句话说，YFP – MS2的荧光恢复，反映了一代人新的MS2在新生的成绩单和荧光自由YFP – MS2的分子，从周围的核质进入其约束力的茎环。 FRAP恢复曲线，然后使用一系列微分方程的数学机械化形式化的模型，以检索转录的动力学参数进行分析。
Protocol
Discussion
用于测量活细胞聚合酶的动能活动的方法，可以分为两个部分。第一部分介绍的“湿”的过程，使mRNA转录的动力学数据测量和检索，而在第二部分中，数据是使用一个ODE模型分析。5一些研究现在已经利用这种方法提取在活细胞内5，6，8，12-14的转录动力学。这些研究之间的主要区别是FRAP恢复曲线转换成动能参数的方式。在许多情况下使用的数学模型。一个模型，描述了一个简单?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS – T是由欧洲研究委员会（ERC），以色列科学基金会（ISF）（250/06），ISF Bikura，以色列癌症研究基金会（ICRF），德国和以色列的科技研究和开发基金会（GIF的支持），美国和以色列两个民族组成的科学基金会（BSF），德国和以色列项目合作（DIP），和以色列科学和健康的部委，并在生命科学，简斯特恩Lebell家庭巴伊兰大学的研究员。 YB是Azrieli Azrieli奖学金奖基金会表示感谢。
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
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