Cinética de RNA polimerase II transcricional são medidos em genes específicos em células vivas. mRNAs transcritos do gene de interesse são fluorescente etiquetado e usando a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) o vivo na cinética de alongamento transcricional são obtidos.
A atividade transcricional da RNA polimerase II (Pol II) é um processo dinâmico e, portanto, a medição da cinética do processo de transcrição in vivo é importante. Pol cinética II foram medidos utilizando métodos bioquímicos ou moleculares. 1-3 Nos últimos anos, com o desenvolvimento de novos métodos de visualização, tornou-se possível seguir a transcrição como ocorre em tempo real em células vivas único. 4 Aqui nós descrevemos como para realizar a análise de Pol II alongamento cinética em um gene específico nas células vivas. 5, 6 Usando uma linha de célula na qual um locus gene específico (DNA), seu produto mRNA, eo produto final pode ser a proteína fluorescente etiquetado e visualizados in vivo , é possível detectar a transcrição de mRNAs real sobre o gene de interesse. 7, 8 O mRNA é fluorescente etiquetado com o sistema MS2 mRNAs para marcação in vivo, onde o 3'UTR de transcritos no mRNA de conter 24 MS2 haste-laço repete, que fornecem altamente específicos sítios de ligação para a proteína casaco YFP-MS2 que rotula o mRNA como é transcrito. 9 Para monitorar a cinética de transcrição usamos a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) método. Por fotobranqueamento as transcrições YFP-MS2-tagged nascente no local da transcrição e, em seguida, após a recuperação deste sinal ao longo do tempo, obtemos a taxa de síntese dos mRNAs recém-feitos. 5 Em outras palavras, YFP-MS2 recuperação de fluorescência reflete a geração de novos MS2-tronco-loops nas transcrições nascente e sua ligação por fluorescentes YFP-MS2 livre moléculas entrem a partir do nucleoplasma circundante. As curvas de recuperação FRAP são então analisados por modelos mecanicistas matemática formalizada por uma série de equações diferenciais, a fim de recuperar os parâmetros de tempo cinética de transcrição.
O método para medir a atividade da polimerase cinética em células vivas podem ser divididos em duas partes. A primeira parte descreve o procedimento de "molhado", que permite a medição e recuperação dos dados cinéticos de transcrição de mRNA, enquanto que na segunda parte, os dados são analisados utilizando um modelo de ODE. 5 A série de estudos têm agora utilizada esta abordagem para extrair cinética de transcrição em células vivas 5, 6, 8, 12-14. A principal difer…
The authors have nothing to disclose.
YS-T é apoiada pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC), o Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Cancer Research Fund Israel (ICRF), alemão-israelense Fundação para Pesquisa e Desenvolvimento Científico (GIF ), EUA-Israel Binacional Science Foundation (BSF), alemão-israelense Projeto de Cooperação (DIP), e os ministérios israelenses de Ciência e Saúde, e é o Jane Stern Fellow Família Lebell em Ciências da Vida da Universidade Bar-Ilan University. YB é grato à Fundação Azrieli para a atribuição de uma bolsa Azrieli.
Name of the reagent | Company |
---|---|
Doxycycline | Sigma |
FuGENE 6 transfection reagent | Roche |