在活细胞中的特定基因上RNA聚合酶II转录的动力学测量。感兴趣的基因转录的mRNA荧光标记,并使用荧光漂白后(FRAP)在体内转录伸长动力学得到恢复。
RNA聚合酶II(聚合酶II)的转录活性,是一个动态的过程, 因此测量在体内的转录过程中的动力学的重要性。聚合酶II动力学测量,利用生化或分子生物学方法。1-3近年来发展的新的可视化方法,它已成为可以遵循的转录发生在单个活细胞的实时4此中,我们介绍了如何执行在活细胞中特定基因的聚合酶II伸长动力学分析,5,6使用的细胞系,其中荧光标记一个特定的基因位点(DNA)的,其mRNA的产品,和最终的蛋白产物可在体内观察,它可以检测到感兴趣的基因转录的mRNA的实际,7,8的mRNA荧光标记使用标记的mRNA在体内,mRNA转录的3'UTR含有24 MS2的茎环MS2的系统重复,提供YFP – MS2外壳蛋白标签的mRNA转录的高度特异性结合位点( 九 )监测转录的动力学我们使用漂白(FRAP)方法后,荧光恢复。通过在转录现场漂白新生成绩单YFP – MS2的标签,然后按照这种信号随时间的恢复,我们取得新的mRNA的合成率。,换句话说,YFP – MS2的荧光恢复,反映了一代人新的MS2在新生的成绩单和荧光自由YFP – MS2的分子,从周围的核质进入其约束力的茎环。 FRAP恢复曲线,然后使用一系列微分方程的数学机械化形式化的模型,以检索转录的动力学参数进行分析。
用于测量活细胞聚合酶的动能活动的方法,可以分为两个部分。第一部分介绍的“湿”的过程,使mRNA转录的动力学数据测量和检索,而在第二部分中,数据是使用一个ODE模型分析。5一些研究现在已经利用这种方法提取在活细胞内5,6,8,12-14的转录动力学。这些研究之间的主要区别是FRAP恢复曲线转换成动能参数的方式。在许多情况下使用的数学模型。一个模型,描述了一个简单?…
The authors have nothing to disclose.
YS – T是由欧洲研究委员会(ERC),以色列科学基金会(ISF)(250/06),ISF Bikura,以色列癌症研究基金会(ICRF),德国和以色列的科技研究和开发基金会(GIF的支持),美国和以色列两个民族组成的科学基金会(BSF),德国和以色列项目合作(DIP),和以色列科学和健康的部委,并在生命科学,简斯特恩Lebell家庭巴伊兰大学的研究员。 YB是Azrieli Azrieli奖学金奖基金会表示感谢。