बाह्य मैट्रिक्स का कठोरता दृढ़ता से पक्षपाती कोशिकाओं के कई व्यवहार को प्रभावित करती है. मैट्रिक्स कठोरता एक ऊतक भर spatially बदलता है, और विभिन्न बीमारी की स्थिति में संशोधन की प्रक्रिया. यहाँ हम परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी microindentation का उपयोग सामान्य और fibrotic माउस फेफड़े के ऊतकों में जकड़न में स्थानिक बदलाव विशेषताएँ तरीकों को विकसित.
मैट्रिक्स कठोरता जोरदार वृद्धि, और पक्षपाती 1-3 कोशिकाओं के भेदभाव समारोह को प्रभावित करती है. मैक्रो पैमाने पर मानव शरीर के भीतर ऊतकों और अंगों की कठोरता 4 परिमाण के कई आदेशों अवधि. बहुत कम कैसे कठोरता ऊतकों के भीतर spatially बदलता है के बारे में जाना जाता है, और गुंजाइश है और कठोरता परिवर्तन के स्थानिक पैमाने पर रोग प्रक्रियाओं में क्या नतीजा है कि ऊतक remodeling में हैं. बेहतर ढंग से समझने कैसे मैट्रिक्स कठोरता में परिवर्तन सेलुलर शरीर विज्ञान के लिए स्वास्थ्य और रोग में योगदान करने के लिए, एक स्थानिक निवासी कोशिकाओं के लिए प्रासंगिक पैमाने पर प्राप्त ऊतक कठोरता के माप की जरूरत है. यह विशेष रूप से फेफड़ों, एक बेहद आज्ञाकारी और लोचदार ऊतक जिसमें मैट्रिक्स remodeling अस्थमा, वातस्फीति, उच्च रक्तचाप, और फाइब्रोसिस जैसे रोगों में एक प्रमुख विशेषता है के लिए सच है. एक स्थानिक निवासी कोशिकाओं के लिए प्रासंगिक पैमाने पर स्थानीय यांत्रिक पर्यावरण फेफड़ों parenchyma विशेषताएँ करने के लिए, हम सीधे ताजा murine फेफड़ों ऊतक का उपयोग परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) microindentation के स्थानीय लोचदार संपत्तियों को मापने के तरीके विकसित किया है. AFM मांगकर्ता, ब्रैकट, और इंडेंटेशन गहराई का उपयुक्त विकल्प के साथ, इन तरीकों चरण विपरीत और हित के क्षेत्र के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ समानांतर में स्थानीय ऊतक अपरुपण मापांक के माप अनुमति देते हैं. ऊतक स्ट्रिप्स के व्यवस्थित नमूने ऊतक यांत्रिक गुणों कि अपरुपण मापांक में स्थानीय स्थानिक विविधताओं से पता चलता है के नक्शे उपलब्ध कराता है. यांत्रिक गुणों और अंतर्निहित शारीरिक और रोग सुविधाओं के बीच Correlations का वर्णन कैसे कठोरता मैट्रिक्स बयान में तंतुमयता के साथ बदलता रहता है. इन विधियों अन्य मुलायम ऊतकों और रोग प्रक्रियाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है प्रकट करने के लिए कैसे स्थानीय ऊतक यांत्रिक गुणों अंतरिक्ष और रोग प्रगति के पार भिन्न है.
फेफड़ों AFM microindentation का उपयोग ऊतक के यांत्रिक लक्षण वर्णन अभूतपूर्व स्थानिक संकल्प (4 छवि) प्रदान करता है, ऊतक कठोरता में microscale रूपांतरों पर एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य प्रदान करते हैं. इसकी उपयोगिता का एक उदाहरण के रूप में सामान्य और fibrotic फेफड़े के ऊतकों स्ट्रिप्स में पिछले वृहद पैमाने पर मापन 11,12 तंतुमयता के साथ एक अनुमानित 2 – 3 गुना elastance में वृद्धि का संकेत दिया. इसके विपरीत, AFM microindentation से पता चलता है कि ऊतक stiffening अत्यधिक स्थानीयकृत ~ सामान्य फेफड़ों ऊतक 10 में मनाया औसत से ऊपर अपरुपण मापांक में 30 गुना बढ़ जाती है के लिए कुछ क्षेत्रों का प्रदर्शन के साथ है. मैट्रिक्स कठोरता के रूप में अब के लिए गंभीर सेल समारोह को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, इन स्थानीय माप अमूल्य पैरामीटर प्रदान करने के लिए फेफड़ों की कोशिकाओं के सेल संस्कृति अध्ययन के biofidelity बढ़ाने.
कई व्यावहारिक मुद्दों फेफड़े के ऊतकों की पतली स्ट्रिप्स के उपयोग के साथ उत्पन्न होती हैं. स्ट्रिप्स के सतहों पूरी तरह से फ्लैट नहीं कर रहे हैं के रूप में ऊतक प्रोफ़ाइल अंतर्निहित अलवियोली की वास्तुकला इस प्रकार है. AFM प्रणाली स्वतः खरोज दौरान Z दिशा में टिप की स्थिति समायोजित कर देता है जब नमूना सतह ऊंचाई भिन्नता 15 – सुक्ष्ममापी की तुलना में छोटे के लिए इस चुनौती पर काबू पाने में मदद है. माप कमरे के तापमान ° सी नहीं 37 पर बना रहे हैं, तो तापमान में इस बदलाव की वजह से यांत्रिक गुणों में विचलन, मूल्यांकन नहीं किया जा हालांकि वे मामूली होने की उम्मीद होगी. मनाया यांत्रिक गुणों पर अंतर्निहित वायुकोशीय दीवार वास्तुकला के प्रभाव वर्तमान प्रकाश माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ तय कर पाना मुश्किल है. उदाहरण के लिए, यह वांछनीय हो सकता है निर्धारित करने के लिए अगर वायुकोशीय दीवारों anisotropy और विभिन्न यांत्रिक गुणों का प्रदर्शन जब साथ गठबंधन या दीवार के विमान के लिए अनुप्रस्थ दिशाओं में दांतेदार बना होगा. हालांकि, मौजूदा नमूनों मोटी हैं और इमेजिंग प्रणाली 3D क्षमताओं नहीं है, इसलिए यह संभव संपर्क के प्रत्येक बिंदु पर स्थानीय वायुकोशीय दीवार ओरिएंटेशन निर्धारित नहीं है. अंत में, मापा यांत्रिक गुणों पर सेलुलर घटक के प्रभाव को पूरी तरह से elucidated किया जाना बना रहता है. यहाँ विस्तृत तरीकों में कोई प्रयास के लिए विशेष रूप से ऊतक के सेलुलर घटक को हटाने के लिए बना रहे हैं. हालांकि, कोशिकाओं इंडेंटेशन के लिए उपलब्ध है की सतह पर मौजूद ऊतक फसल और ऊतकों को काटने के लिए अलवियोली के लिए पहुँच प्राप्त करने की आवश्यकता के बाद से elapsed समय दिया व्यवहार्य हो की संभावना नहीं कर रहे हैं. विशिष्ट कोशिकाओं को हटाने के लिए, या व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ matrices जनसंख्या फिर से बढ़ा है, और ऊतक कठोरता में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन का मूल्यांकन प्रयोगों warranted प्रकट होता है.
क्योंकि ताजा unfixed ऊतक इन मापों के लिए की जरूरत है, ऊतक फसल से माप elapsed समय और कम से कम किया जाना चाहिए है डिग्री सेल्सियस यांत्रिक गुणों में परिवर्तन से बचने के लिए नमूने 4 में संग्रहित किया जाना चाहिए. जब भी ऊतक स्ट्रिप्स कंटेनरों के बीच धोने या तो धुंधला हो जाना है कि न्यूनतम विरूपण या क्षति उत्पन्न होता है के दौरान स्थानांतरित कर रहे हैं विशेष रूप से ध्यान दिया जाना चाहिए. तरल में AFM के आवेदन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में संभव के रूप में फ्लैट ऊतक में कटौती और समर्थन coverslip पर नमूना स्थिर है. यदि उपलब्ध है, एक स्वचालित सेक्शनिंग एक vibratome या ऊतक slicer के रूप में ऐसी मशीन अत्यधिक वर्दी मोटाई के स्लाइस में कटौती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतक स्ट्रिप्स तुरंत पहले AFM माप देते AFM माप के लिए elapsed समय के रूप में नमूना अंततः coverslips से अलग होगा कम से कम यह महत्वपूर्ण है. एक उपयोगी टिप्पणी है कि बड़े स्ट्रिप्स अधिक फिसल जाता है कवर और पीबीएस में छोटे स्ट्रिप्स से अधिक लंबी durations के लिए जगह में रहते हैं stably देते हैं दिखाई देते हैं.
AFM microindentation 100 पा से 50 kPa (अपरुपण मापांक) के लिए एक व्यापक रेंज फैले नमूनों जब एक 5 सुक्ष्ममापी व्यास गोलाकार टिप के साथ एक मानक 0.06 N / मीटर ब्रैकट का उपयोग चिह्नित कर सकते हैं. गोलाकार कांच 0.01 से लेकर 0.58 एन / मीटर व्यास और वसंत स्थिरांक में 0.6 से 12 सुक्ष्ममापी से वाणिज्यिक (जैसे Novascan) उपलब्ध है और आमतौर पर 3 इस्तेमाल किया लेकर सुझावों के साथ AFM जांच, इस रेंज अलग वसंत स्थिरांक के साथ जांच का उपयोग करके विस्तारित किया जा सकता है. एक 5 सुक्ष्ममापी गोलाकार टिप के साथ, टिप और ऊतकों के बीच सैद्धांतिक संपर्क क्षेत्र 400-700 एनएम खरोज (छवि 1A) के लिए 5-9 के बारे में 2 सुक्ष्ममापी है. छोटे या बड़े सुझावों स्थानिक संकल्प के छोटे या बड़े पैमाने प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पिरामिड सुझावों AFM microindentation 13-16 में भी इस्तेमाल किया गया है, छोटे संपर्क क्षेत्रों प्रदान करने और इस तरह मानचित्रण में स्थानिक संकल्प में वृद्धि, हालांकि डेटा फिटिंग इस टिप ज्यामिति के लिए और अधिक जटिल है.
इस विधि के लिए कई सीमाओं ध्यान दिया जाना चाहिए. फेफड़ों यंत्रवत् है परंपरागत गैर invasively दबाव मात्रा 17 विश्लेषण या पूरे फेफड़ों के पंच – इंडेंटेशन 19,20 का उपयोग उदाहरण के लिए, विशेषता . यहाँ हवा तरल int के नुकसान के माध्यम से महत्वपूर्ण मायनों में फेफड़ों वास्तुकला बदल वर्णित एक जैसे आक्रामक तरीकेerface है कि आम तौर पर हवा भरे फेफड़ों और पूर्व तनाव के नुकसान है कि सांस की मांसपेशियों की छूट पर फेफड़ों आंशिक मुद्रास्फीति रखता में मौजूद है. इन सीमाओं को फेफड़े के ऊतकों 18 स्ट्रिप्स में किए गए सभी मापन के लिए आम हैं. विशेष रूप से, तथापि, मंझला कठोरता सामान्य फेफड़े के ऊतकों के parenchyma (अपरुपण मापांक 0.5kPa ~) में मापा आराम 19,20 मात्रा पर बरकरार फेफड़ों के पंच – इंडेंटेशन के आधार पर अनुमान से अलग नहीं है काफी . जबकि फेफड़े के ऊतकों बढ़ती विरूपण के साथ गैर रेखीय stiffening प्रदर्शन के लिए जाना जाता है, यह संभव नहीं है एक कठोर फैशन में परीक्षण है कि इस संपत्ति सूक्ष्म पैमाने के लिए नीचे यहाँ नियोजित तरीके के साथ बनी रहती है. हर्ट्ज मॉडल नमूने की समरूपता हो जाती है. हालांकि, फेफड़ों parenchyma सहित सबसे जैविक सामग्री, तेजी से स्थानिक तराजू घटते पर विषम हैं. नमूना की विविधता यंग मापांक के खरोज की गहराई पर निर्भर करता है, अर्थात् परत या घटक है कि deforming है पर निर्भर करता है भिन्नता की तरह कलाकृतियों में परिणाम कर सकते हैं. xy विमान में विविधता ध्यान से उपयुक्त गोलाकार टिप आकार Dimitriadis ई.के. एट अल द्वारा प्रस्तावित के रूप में biomaterial के microstructure पर निर्भर करता है चुनने के द्वारा सीमित किया जा सकता यह 8 अधिक मुश्किल भविष्यवाणी करने या हर्ट्ज मॉडल सामग्री के लिए कारण त्रुटि सही है. z दिशा में विविधता. Azeloglu एट अल. हाल ही में एक संकर कम्प्यूटेशनल मॉडल के असतत एम्बेडेड 21 inclusions के साथ विषम सब्सट्रेट की लोचदार संपत्तियों विशेषताएँ प्रस्ताव. उनकी नई तकनीक प्रदान करता है एक संभावित विषम Hertzian विश्लेषण की सीमाओं पर काबू पाने सामग्री का समावेश गुण की गणना का मतलब है.
हर्ट्ज मॉडल भी पूर्ण लोचदार व्यवहार मानता है, जबकि जैविक सामग्री आम तौर पर समय पर निर्भर viscoelastic व्यवहार प्रदर्शित. ऊतक के एक पूर्ण viscoelastic लक्षण वर्णन इंडेंटेशन इस्तेमाल किया वेग अलग से प्राप्त किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, पिछले वृहद पैमाने पर सामान्य और fibrotic फेफड़े के ऊतकों के यांत्रिक परीक्षण फेफड़े के ऊतकों के यांत्रिक गुणों के कमजोर आवृत्ति निर्भरता, और सभी आवृत्तियों भर में सामान्य और fibrotic ऊतक यांत्रिक गुणों के बीच मतभेद के संरक्षण को दर्शाता है 11 का परीक्षण किया. इन निष्कर्षों को दृढ़ता से सुझाव है कि यांत्रिक AFM के साथ एक एकल इंडेंटेशन वेग का उपयोग गुणों की माप ऊतक यांत्रिक गुणों में परिवर्तन है कि तंतुमयता के साथ का एक अनिवार्य पहलू को दर्शाता है.
पॉसों के अनुपात 0.4 फेफड़ों के इस काम में इस्तेमाल किया ऊतक के लिए के एक macroscopic 9 माप से है . दुर्भाग्य से, सूक्ष्म पैमाने पर पॉसों के अनुपात और रोग की शर्त के तहत किसी भी परिवर्तन साहित्य में उपलब्ध नहीं हैं. ई / ई (1 υ 2) या (1 υ 2) / πE विकल्प (के रूप में लोचदार निरंतर कश्मीर चिह्नित) 22 AFM microindentation से गणना की जा सकता है और रिपोर्ट जब पॉसों के अनुपात अज्ञात है. पॉसों के अनुपात सबसे biomaterials के लिए अपने उच्च पानी सामग्री के कारण 0,4 से 0,5 की रेंज में है. 0.3-0.5 रेंज के भीतर, 1 / (1 υ 2) कारक 1.10-1.33 से ही बदलता है, जैसे कि पॉसों के अनुपात में उचित बदलाव रिपोर्ट मापांक पर केवल मामूली प्रभाव डालती है. अपरुपण मापांक है कि हम सामान्य ऊतकों को fibrotic ऊतक रिश्तेदार के लिए रिपोर्ट में वृद्धि परिमाण में कई गुना है, जिसका अर्थ है कि पॉसों के अनुपात में बदलाव के साथ जुड़े त्रुटियों यांत्रिक गुणों में परिवर्तन मनाया मामूली रिश्तेदार हैं.
वास्तविक एल्गोरिथ्म और कोड है कि बल विस्थापन डेटा के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विशिष्ट अनुप्रयोग हालत और बल विस्थापन घटता के विविध आबादी के बाद विशेषताओं के अधीन है. यदि और अधिक परिष्कृत विश्लेषण ब्याज की है, एक लिन एट अल के काम से परामर्श 23. सकता है. लेखक एक एल्गोरिथ्म है कि जटिलताओं कि पहले इंडेंटेशन डेटा की हर्ट्ज मॉडल की फिटिंग को स्वचालित करने के प्रयासों अवस्र्द्ध है के कई पर काबू में synergistic रणनीतियों की एक श्रृंखला तैयार की.
कई अन्य क्षेत्रों में आगे और इस पद्धति का विकास शोषण के लिए उपलब्ध हैं. मामलों में जहां एक एंटीबॉडी लेबलिंग के बिना वायुकोशीय दीवारों visualizing में रुचि है, दोनों elastin और कोलैजेन उनके हरे रंग स्पेक्ट्रम में autofluorescent संकेत से visualized किया जा सकता है. दूसरी ओर, बेहतर इमेजिंग, या तो पतली ऊतक वर्गों, 3 डी इमेजिंग तकनीक, या दोनों का उपयोग कर, के यांत्रिक गुणों अंतर्निहित ऊतक वास्तुकला के साथ सहसंबंधी की क्षमता को बढ़ा सकता है. जबकि मौजूदा तरीकों धुंधला हो जाना और कोलेजन और laminin जैसे बाह्य मैट्रिक्स घटकों के दृश्य की अनुमति, अतिरिक्त प्रयास कोशिका की सतह मार्करों धुंधला के लिए विशेष सेल आबादी की पहचान और ऐसी आबादी के आसपास के क्षेत्र में यांत्रिक microenvironments विशेषताएँ करने के उद्देश्य से किया जा सकता है. ऑल्टernatively, ऊतक मार्करों या सेल विशिष्ट प्रोटीन वंश fluorescently टैग व्यक्त करने के लिए एक ही लक्ष्य का पीछा चूहों से काटा जा सकता है है. अंत में, विधि यहाँ विस्तृत अच्छी तरह से करने के लिए फेफड़ों में अन्य संरचनात्मक सुविधाओं जैसे उच्च रक्तचाप में जो फिर से तैयार बर्तन, अस्थमा में जो फिर से तैयार करना और वायुमार्ग, निस्र्पक अनुकूल प्रतीत होता है. और आगे बढ़ाने के लिए क्षमता विकास की वर्तमान स्थिति के आधार पर AFM microindentation ऊतक कठोरता में परिवर्तन है कि फेफड़ों में रोग प्रगति के साथ में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि उपज के लिए तैयार दिखाई देता है, और नहीं में स्थानिक और लौकिक परिवर्तन निस्र्पक में मूल्य का हो शक नहीं होगा अन्य मुलायम ऊतकों की एक किस्म की कठोरता.
The authors have nothing to disclose.
हम चल रहे उनके सहयोग के लिए ए Tager और बी एक प्रकार का वृक्ष धन्यवाद, और फेफड़ों के प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया ऊतक प्रदान करने के लिए यहाँ. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य HL +०,९२,९६१ अनुदान संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया था. इस काम के हिस्से में नेनो पैमाने सिस्टम (सीएनएस), राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क का एक सदस्य है, जो NSF पुरस्कार ईसीएस +०३३५७६५ के अंतर्गत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है के लिए केंद्र में प्रदर्शन किया गया था. सीएनएस हार्वर्ड विश्वविद्यालय में कला और विज्ञान के संकाय का हिस्सा है.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |