A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.
Rigidez da matriz influencia fortemente o crescimento, diferenciação e função de células aderentes 1-3. Na escala macro a rigidez dos tecidos e órgãos dentro do corpo humano vão várias ordens de magnitude 4. Muito menos se sabe sobre como a rigidez varia espacialmente dentro dos tecidos, e que o escopo ea escala espacial de mudanças nos processos de rigidez são doenças que resultam na remodelação do tecido. Para entender melhor como as mudanças na matriz de rigidez contribuem para a fisiologia celular na saúde e na doença, a medida da rigidez do tecido obtido em uma escala espaciais relevantes para células residentes são necessários. Isto é particularmente verdadeiro para o pulmão, um tecido altamente compatível e elástica em que a remodelação da matriz é uma característica proeminente em doenças como asma, enfisema, hipertensão e fibrose. Para caracterizar o ambiente local mecânica do parênquima pulmonar em uma escala espaciais relevantes para células residentes, temos desenvolvido métodos para medir diretamente as propriedades locais elástica do tecido pulmonar fresco murino usando microscopia de força atômica microindentation (AFM). Com a escolha adequada de AFM indentor, cantilever, e profundidade de indentação, estes métodos permitem medições do módulo de cisalhamento locais tecido em paralelo com contraste de fase e imagens de fluorescência da região de interesse. Amostragem sistemática de tiras de tecido fornece mapas das propriedades mecânicas dos tecidos que revelam locais variações espaciais no módulo de cisalhamento. Correlações entre propriedades mecânicas e características anatômicas subjacentes e patológicos ilustrar como a rigidez varia de acordo com deposição de matriz na fibrose. Estes métodos podem ser alargada a outros tecidos moles e processos da doença para revelar como as propriedades mecânicas dos tecidos locais variam no espaço e progressão da doença.
Caracterização mecânica de tecido pulmonar usando microindentation AFM oferece resolução espacial sem precedentes (Fig. 4), proporcionando uma perspectiva única sobre as variações microescala na rigidez do tecido. Como exemplo de sua utilidade, anterior macro-escala medidas em tiras de tecido normal e fibrótica pulmonar indicaram um aumento de 2 a 3 vezes aproximado em elastância com fibrose 11,12. Em contraste, microindentation AFM revela que enrijecimento dos tecidos é extremamente localizada, com algumas regiões apresentando até ~ aumenta 30 vezes no módulo de cisalhamento acima da média observada no tecido pulmonar normal 10. Como a rigidez da matriz é agora conhecido por influenciam criticamente a função das células, estas medições locais fornecem parâmetros de valor inestimável para melhorar a biofidelity de estudo de cultura celular de células do pulmão.
Várias questões práticas surgem com o uso de finas tiras de tecido pulmonar. As superfícies das tiras não são perfeitamente planas, como o perfil do tecido segue a arquitetura dos alvéolos subjacentes. O sistema ajusta automaticamente a posição AFM ponta na direção Z, durante o recuo quando a amostra variação da altura da superfície é menor do que 15 mícrons para ajudar a superar este desafio. As medições são feitas em temperatura ambiente, e não 37 ° C, por isso os desvios nas propriedades mecânicas causadas por essa variação de temperatura não pode ser avaliado, ainda que seria esperado a ser menor. A influência da arquitetura da parede alveolar subjacente sobre observado propriedades mecânicas é difícil determinar com a configuração atual microscopia de luz. Por exemplo, seria desejável para determinar se as paredes alveolares apresentam anisotropia e diferentes propriedades mecânicas quando recuado em direções alinhadas com ou transversal ao plano da parede. No entanto, os espécimes atuais são grossas e do sistema de imagem não tem capacidades 3D, portanto, não é possível determinar a orientação da parede alveolar locais em cada ponto de contato. Finalmente, a influência de constituintes celulares na medida propriedades mecânicas continua a ser totalmente elucidado. Nos métodos detalhados aqui, não são feitos esforços para remover especificamente constituintes celulares do tecido. No entanto, as células presentes na superfície disponível para o recuo é pouco provável que seja viável, dado o tempo decorrido desde a colheita de tecidos e da necessidade de cortar o tecido para ter acesso aos alvéolos. Experimentos específicos para remover as células, ou matrizes de repovoar com células viáveis, e avaliar as alterações resultantes da rigidez do tecido parece garantido.
Porque o tecido unfixed fresca é necessária para estas medições, o tempo decorrido desde a colheita de tecidos para a medição deve ser minimizado e as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C para evitar alterações nas propriedades mecânicas. Atenção especial deve ser dada sempre que tiras de tecido são transferidos entre recipientes durante a lavagem ou coloração de modo que um mínimo de distorção ou dano é gerado. AFM para aplicação no estado líquido, é um passo crucial para cortar o tecido o mais plano possível e imobilizar a amostra sobre a lamínula de apoio. Se disponível, uma máquina automática de corte tal como um cortador de tecidos vibratome ou pode ser usado para cortar fatias de espessura altamente uniforme. É importante anexar tiras de tecido imediatamente antes das medidas AFM e minimizar o tempo decorrido para medições AFM como a amostra acabará por retirar do lamínulas. Uma observação útil é que tiras maiores parecem atribuir mais estável para cobrir escorrega e permanecer no local por períodos mais longos do que em PBS tiras menores.
Microindentation AFM pode caracterizar amostras que abrangem uma ampla gama de 100 Pa a 50 kPa (módulo de cisalhamento) ao usar um padrão de 0,06 N / m cantilever com uma ponta de 5 mm de diâmetro esférico. Esse intervalo pode ser expandida usando sondas com constantes primavera diferente; sondas AFM com pontas de vidro esférico variando 0,6-12 m de diâmetro e primavera constantes variando de 0,01 e 0,58 N / m estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Novascan) e comumente utilizado 3. Com uma ponta esférica 5 mm, a área de contato entre a ponta teórica e tecido é de cerca de 5-9 mM 2 para o recuo 400-700 nm (Fig. 1A). Dicas menores ou maiores podem ser usados para fornecer escalas menores ou maiores de resolução espacial. Dicas piramidal também têm sido utilizados na AFM microindentation 13-16, fornecendo áreas menores contato e assim aumentar a resolução espacial no mapeamento, embora ajuste dos dados é mais complexo para esta geometria da ponta.
Várias limitações para este método deve ser observado. O pulmão tem sido tradicionalmente caracterizada mecanicamente não-invasiva, por exemplo, usando análise de pressão-volume 17 ou soco recuo de toda pulmões 19,20. Métodos invasivos, como a descrita aqui alterar a arquitetura pulmonar em aspectos importantes, devido à perda da int ar-líquidoerface que normalmente existe no pulmão cheio de ar ea perda de pré-esforço que mantém a inflação pulmonar parcial sobre o relaxamento dos músculos respiratórios. Estas limitações são comuns a todas as medições feitas em tiras de tecido pulmonar 18. Notavelmente, entretanto, a rigidez média medida no parênquima do tecido pulmonar normal (módulo de cisalhamento ~ 0,5 kPa) não diferem substancialmente das estimativas com base no soco recuo de pulmões intactos em volumes descansando 19,20. Enquanto o tecido pulmonar é conhecido por apresentar não-linear com rigidez a deformação crescente, não é possível testar de forma rigorosa se esta propriedade persistir até a escala micro, com os métodos empregados aqui. O modelo de Hertz assume homogeneidade da amostra. No entanto, a maioria dos materiais biológicos, incluindo parênquima pulmonar, são cada vez mais heterogénea a diminuir escalas espaciais. Heterogeneidade da amostra pode resultar em artefatos como variação do módulo de Young, dependendo da profundidade de indentação, ou seja, dependendo da camada ou componente que está deformando. A heterogeneidade no plano xy pode ser limitada por escolher cuidadosamente o tamanho da ponta esférica apropriado, dependendo da microestrutura do biomaterial, tal como proposto por Dimitriadis EK et al. 8 É muito mais difícil de prever ou corrigir o erro do modelo Hertz devido ao material heterogeneidade na direção z. Azeloglu et al. propôs recentemente um modelo híbrido computacional para caracterizar as propriedades elásticas do substrato heterogêneo com discreta inclusões embutidos 21. A nova técnica fornece um meio potencial para calcular propriedades inclusão de materiais heterogêneos superar as limitações da análise hertzianas.
O modelo de Hertz também assume comportamento elástico absoluto, enquanto que materiais biológicos normalmente exibem comportamentos dependentes do tempo viscoelástico. A caracterização viscoelástica cheio de tecido pode ser obtida através da variação da velocidade de recuo usadas. Importante, testes de macro-escala anterior mecânicas do tecido pulmonar normal e fibrótico demonstra a dependência fraca frequência das propriedades mecânicas do tecido pulmonar e preservação das diferenças entre as propriedades do tecido normal e fibrótica mecânica em todas as freqüências testadas 11. Estas descobertas sugerem fortemente que a medição de propriedades mecânicas utilizando uma velocidade única, com recuo AFM capta um aspecto essencial das mudanças nas propriedades mecânicas do tecido que acompanham fibrose.
O coeficiente de Poisson de 0,4 para tecido pulmonar utilizado neste trabalho é de uma medida macroscópica 9. Infelizmente, o coeficiente de Poisson em micro-escala e as alterações sob condição da doença não estão disponíveis na literatura. Como alternativas para E, E / (1-υ 2) ou (1-υ 2) / πE (indicado a constante elástica k) 22 pode ser calculado a partir microindentation AFM e relatados quando o coeficiente de Poisson é desconhecida. Para a maioria dos biomateriais coeficiente de Poisson está na faixa de 0,4-0,5 devido ao seu alto teor de água. Dentro da faixa de 0,3-0,5, o fator 1 / (1-υ 2) varia apenas 1,10-1,33, de modo que variações razoáveis em relação ao de Poisson exercem apenas efeitos modestos sobre o módulo relatados. O aumento no módulo de cisalhamento que relatório para relação tecido fibrótico ao tecido normal é várias vezes em magnitude, o que implica que os erros associados a variações no coeficiente de Poisson são relativos menores para as mudanças nas propriedades mecânicas observadas.
O algoritmo de reais e código que pode ser utilizado para a análise da força-deslocamento de dados está sujeito à condição de aplicação específica e as características subseqüentes das diversas populações de força-deslocamento curvas. Se uma análise mais sofisticada é de interesse, pode-se consultar o trabalho de Lin et al. 23. Os autores compilaram uma série de estratégias sinérgicas em um algoritmo que supera muitas das complicações que já impedido os esforços para automatizar a montagem de modelos de dados Hertz recuo.
Várias outras áreas estão disponíveis para desenvolvimento e exploração deste método. Nos casos em que alguém está interessado em visualizar as paredes alveolares sem rotulagem de anticorpos, ambos elastina e colágeno pode ser visualizado a partir de seu sinal autofluorescent no espectro verde. Por outro lado, uma melhor imagem, usando cortes mais finos tecidos, técnicas de imagem 3D, ou ambos, poderão aumentar a capacidade de correlacionar arquitetura do tecido subjacente com propriedades mecânicas. Embora os métodos atuais permitem coloração e visualização de componentes da matriz extracelular, como colágeno e laminina, esforços adicionais poderiam ser destinadas a coloração marcadores de superfície celular para identificar populações de células específicas e de caracterizar o microambiente mecânica nas proximidades dessas populações. Alternatively, o tecido poderia ser colhida a partir de camundongos expressando-fluorescente etiquetados marcadores de linhagem de células ou proteínas específicas para perseguir o mesmo objetivo. Finalmente, o método detalhado aqui aparece bem colocada para caracterizar outras características anatômicas do pulmão, tais como vasos que remodelar na hipertensão, e das vias aéreas que remodelar na asma. Com base em seu estado atual de desenvolvimento e potencial para reforçar ainda mais, microindentation AFM aparece pronta para produzir insights valiosos sobre as mudanças na rigidez do tecido que acompanham a progressão da doença no pulmão, e será sem dúvida de valor na caracterização de alterações espaciais e temporais na rigidez de uma variedade de outros tecidos moles.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a A. e B. Shea Tager por sua colaboração em curso, e para fornecer o tecido pulmonar utilizado para fins de demonstração aqui. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder HL-092961. Este trabalho foi realizado em parte do Centro de Sistemas em nanoescala (CNS), um membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura, que é apoiado pela National Science Foundation sob NSF prêmio ECS-0335765. CNS é parte da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Harvard.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |