细胞外基质的刚度强烈地影响着贴壁细胞的多种行为。矩阵刚度不同空间在整个组织,并在各种疾病的情况下发生的修改。在这里,我们开发方法来表征的空间变化,在正常和纤维化小鼠肺组织的刚度,使用原子力显微镜microindentation。
矩阵刚度强烈地影响着1-3的贴壁细胞生长,分化和功能。在宏观尺度的组织和器官在人体内的刚度,跨越几个数量级4订单。更别提了解如何刚度空间内组织的变化,刚度变化的范围和空间尺度疾病过程中,在组织重构的结果。为了更好地了解如何在矩阵刚度的变化在健康和疾病的细胞生理学,在相关的空间尺度,居民细胞获得组织刚度的测量是必要的。这是肺,高度兼容和弹性纤维组织基质重塑是一个突出的特点,如哮喘,肺气肿,高血压和纤维化等疾病尤其如此。为了描述在空间尺度上,有关居民细胞肺实质本地的力学环境,我们已经开发出直接测量新鲜小鼠肺组织利用原子力显微镜(AFM)microindentation局部弹性性能的方法。有了适当的选择,AFM的压头,悬臂式,并压痕深度,这些方法允许相衬和感兴趣的区域的荧光成像并行局部组织的剪切模量的测量。组织带系统抽样提供了组织机械性能,剪切模量,揭示了当地的空间变化的地图。机械性能及相关的解剖和病理特征之间的相关性说明如何刚度与基质沉积在肝纤维化的变化。这些方法可以扩展到其它软组织疾病的进程,揭示局部组织的力学性能如何跨越空间和疾病的进展而异。
肺组织使用原子力显微镜microindentation的机械特性,提供了前所未有的空间分辨率(图4),提供一个独特的视角对微观组织的刚度变化。由于其效用的一个例子,以前的宏观尺度的测量表明在正常和纤维化的肺组织条近似倒电容与纤维化11,12增加2 3倍。相比之下,原子力显微镜microindentation显示,一些地区参展〜30倍,在正常肺组织10中观察到的中位数以上的剪切模量的增加,该组织变硬是高度本地化的。作为基体刚度是目前已知看房影响细胞功能,这些地方的测量提供了宝贵的参数,以提高细胞肺癌细胞培养研究biofidelity。
几个实际问题的产生与使用细条状的肺组织。条表面完全平坦,为组织配置文件如下的基本肺泡架构。 AFM系统自动调整在压痕探针在Z方向的位置时,样品表面的高度变化超过15微米的小,以帮助克服这一挑战。测量是在室温,37℃,所以不能在这种温度变化所造成的机械性能偏差评估,尽管他们会预计将轻微。底层的肺泡壁结构上观察到的机械性能的影响是难以确定,与目前的光学显微镜设置。举例来说,将是可取的,以确定是否肺泡壁时,表现出的各向异性和不同的力学性能符合或横墙的平面的方向缩进。然而,当前的标本厚成像系统没有3D功能,因此它是不可能在每个接触点,以确定当地的肺泡壁方向。最后,细胞成分的测量机械性能的影响仍有待完全阐明。在这里详细的方法,没有作出努力,特别是消除组织的细胞成分。然而,细胞表面压痕可用目前是不大可能是可行的,自组织收获和切割组织进入到肺泡的必要性所经过的时间。具体的实验,去除细胞,或与活细胞重新填充矩阵,评估组织刚度产生的变化会出现必要的。
由于这些测量需要新鲜不固定的组织,从组织收获已过测量时间应尽量减少和样品应保存在4 ° C,以避免在机械性能的变化。每当组织条在洗涤或染色,以便产生最小的失真或损坏容器之间转移支付,应特别注意。原子力显微镜在液体中的应用,一个关键步骤是削减尽可能扁平的组织和支持盖玻片固定的样品。如果可用,作为vibratome或组织切片机自动切片机,可以用来切割高度厚度均匀的片。重要的是立即组织带附加AFM测量前,尽量减少AFM测量经过的时间,作为样品将最终脱离的盖玻片。一个有用的观察,出现较大条连接更加稳定盖玻片,并留在原地,持续时间较长的PBS比较小条。
原子力显微镜的microindentation可以表征样本,涵盖了广泛的范围从100帕到50千帕(剪切模量)一起使用时,一个直径5微米的球形提示一个标准的0.06牛顿/米的悬臂。这个范围可以扩大使用与不同的弹簧常数探针;原子力显微镜探针与球面玻璃从0.6至12微米范围从0.01至0.58牛顿/米的直径和弹簧常数不等市售(例如Novascan),常用3的提示。 5微米的球形提示,提示和组织之间的理论的接触面积约5-9微米为400-700纳米压痕( 图 1A )2。更大或更小的技巧可以被用来提供更大或更小尺度的空间分辨率。锥体提示也被用于在原子力显微镜microindentation 13-16,提供更小的接触面积,从而增加映射的空间分辨率,虽然数据拟合这个尖几何形状更为复杂。
这种方法应注意的几个限制。肺历来被机械的非侵入性的特点,例如使用压力-容积分析 17或整个肺部穿孔缩进 19,20 。这里描述的改变肺结构的重要途径之一通过空气液体INT的损失,如侵入性的方法erface,通常在充满空气的肺和预应力的损失,保持呼吸道肌肉放松后肺局部通胀存在。这些限制是在肺组织带18的所有测量的共同。然而,值得注意的是,中位数刚度测量在正常肺组织的实质(剪切模量〜0.5kPa)不大幅不同于基于 19,20休息卷完好肺部穿孔缩进的估计。虽然肺组织表现出越来越变形的非线性劲,它是不可能的,在严格的方式进行测试,这个属性是否仍然存在,这里的方法,以微观尺度。赫兹模型假设样本的同质性。但是,大多数生物材料,包括肺实质,越来越多地在减少空间尺度上的异构。样本的异质性,可能会导致文物如根据压痕深度,即取决于层或元件,是变形的杨氏模量的变化。在XY平面的异质性,可以通过仔细选择合适的球形针尖大小,取决于Dimitriadis EK等提出的生物材料的微观结构有限8这是更难以预测或不正确的赫兹模式错误,由于材料。在z方向的异质性。 Azeloglu等。最近提出了一种混合计算模型来表征异构基板的弹性性能与离散嵌入式夹杂21。他们的新技术提供了潜在的手段来克服赫兹分析的局限性的非均质材料计算列入属性。
赫兹模型还假定绝对的弹性行为,而生物材料通常显示随时间变化的粘弹性行为。一个完整的组织粘弹特性,可通过改变所使用的压痕速度。更重要的是,以前的宏观尺度的机械测试显示正常和纤维化的肺组织肺组织的力学性能弱的频率的依赖,并保存所有频率的正常和纤维化组织的力学性能之间的差异测试11。这些研究结果有力地表明,使用一个单一的压痕速度与原子力显微镜的机械性能的测量捕获组织的力学性能的变化,伴随着肝纤维化的一个重要方面。
0.4肺组织在这项工作中使用的泊松比是从宏观的测量9。不幸的是,在微观尺度的泊松比,并根据病情的任何变化都没有在文献中。 22作为替代品E,E /(1 -υ2)或(1 -υ2)/πE(表示弹性常数k)可以计算出原子力显微镜microindentation和报告时的泊松比是未知的。对于大多数生物材料的泊松比是在0.4至0.5的范围内,由于其含水量高。在0.3-0.5的范围内,只有从1.10-1.33因子1 /(1 -υ2)不同,这样合理的泊松比的变化对报告模量的影响有限。 ,我们为纤维组织相对正常组织报告的剪切模量的增加幅度的数倍,这意味着与泊松比的变化相关联的错误是轻微的相对力学性能的变化观察。
具体应用条件和后续力 – 位移曲线的不同人群的特点是受力 – 位移数据的分析,可以使用实际的算法和代码。如果感兴趣的是更复杂的分析,一个可咨询林等人的工作。23 。作者编译成一系列的协同战略的一个算法,克服了许多先前已阻碍了努力自动化赫兹压痕数据模型的拟合并发症。
其他几个领域的进一步发展,并利用此方法可用。其中一个是在可视化没有抗体标记的肺泡壁有兴趣的情况下,弹性蛋白和胶原蛋白可以从他们在绿色光谱autofluorescent信号的可视化。另一方面,更好的成像,使用或者稀释剂的组织切片,三维成像技术,或两者,可以加强相互联系的能力与组织架构的基本力学性能。虽然目前的方法使细胞外基质成分,如胶原蛋白和层粘连蛋白的染色和可视化,更多的努力可以针对染色细胞表面标志确定具体的细胞群,并在这些人群中附近机械的微环境特征。 Alt键ernatively,组织可收获小鼠表达谱系标记或细胞的特定蛋白质荧光标记的追求相同的目标。最后,该方法的详细,出现在这里非常适合描述其他解剖特点,如改造中高血压的船只,并改造在哮喘气道,肺,。根据其目前的发展和进一步提高的潜力状态,原子力显微镜microindentation似乎准备组织刚度的变化,陪在肺部疾病进展产生有价值的见解,无疑将是有价值的,在时空变化特征在刚度的各种其他软组织。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢他们正在进行的合作A. Tager和B。乳木果,并提供用于演示目的的肺组织。这项工作是由国家卫生补助HL – 092961研究院的支持。这项工作是在纳米系统(CNS),国家纳米技术基础设施网络的成员,这是由国家科学基金会的支持下国家科学基金会奖ECS – 0335765中心部分。中枢神经系统是在哈佛大学艺术和科学学院的一部分。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |