La rigidité de la matrice extracellulaire influence fortement les comportements multiples de cellules adhérentes. Matrice de rigidité varie spatialement à travers un tissu, et subit des modifications dans les diverses maladies. Ici, nous développons des méthodes pour caractériser les variations spatiales de la rigidité dans le tissu pulmonaire normal de la souris et fibrotiques utilisant la microscopie à force atomique microindentation.
Matrice de rigidité influence fortement la croissance, la différenciation et la fonction des cellules adhérentes 1-3. A l'échelle macro de la rigidité des tissus et des organes dans le corps humain durée de plusieurs ordres de magnitude 4. On connaît beaucoup moins sur la façon dont la raideur varie spatialement dans les tissus, et ce que la portée et l'échelle spatiale des variations de rigidité sont dans les processus de la maladie qui en résultent dans le remodelage tissulaire. Afin de mieux comprendre comment les changements dans matrice de rigidité de contribuer à la physiologie cellulaire de la santé et la maladie, les mesures de la rigidité des tissus obtenus à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes sont nécessaires. Cela est particulièrement vrai pour le poumon, un tissu très compatible et élastique dans laquelle remodelage de la matrice est une caractéristique importante de maladies comme l'asthme, l'emphysème, l'hypertension et fibrose. Pour caractériser l'environnement local mécanique du parenchyme pulmonaire à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes, nous avons développé des méthodes pour mesurer directement les propriétés élastiques locales du tissu pulmonaire murin frais en utilisant la microscopie à force atomique (AFM) microindentation. Avec un choix approprié de l'AFM pénétrateur, cantilever, et la profondeur d'indentation, ces méthodes permettent de mesurer des locaux module de cisaillement des tissus en parallèle avec contraste de phase et d'imagerie de fluorescence de la région d'intérêt. L'échantillonnage systématique des bandes de tissus fournit des cartes des propriétés mécaniques des tissus locaux qui révèlent des variations spatiales dans le module de cisaillement. Les corrélations entre les propriétés mécaniques et sous-jacentes des caractéristiques anatomiques et pathologiques illustrent la façon dont la raideur varie avec dépôt de matrice de la fibrose. Ces méthodes peuvent être étendues à d'autres tissus mous et des processus de la maladie de révéler comment les propriétés mécaniques des tissus locaux varient à travers l'espace et de progression de la maladie.
Caractérisation mécanique du tissu pulmonaire à l'aide microindentation AFM offre une résolution spatiale sans précédent (fig. 4), offrant une perspective unique sur les variations de la rigidité du tissu micro. Comme exemple de son utilité, antérieure à macro-échelle des mesures dans des conditions normales et fibrotiques bandes tissu pulmonaire indique une approximative 2-3-fois plus élastance de fibrose 11,12. En revanche, microindentation AFM révèle que la rigidification des tissus est très localisée, avec certaines régions présentant jusqu'à ~ augmente de 30 fois dans le module de cisaillement au-dessus de la médiane observée dans le tissu pulmonaire normale 10. Comme matrice de rigidité est maintenant connue pour influencer la fonction critique de cellules, ces mesures locales de fournir des paramètres précieux pour améliorer la biofidélité de l'étude de culture cellulaire de cellules du poumon.
Plusieurs questions pratiques se posent avec l'utilisation de fines lanières de tissu pulmonaire. Les surfaces des bandes ne sont pas parfaitement plat, comme le profil des tissus suit l'architecture des alvéoles sous-jacentes. Le système ajuste automatiquement la position AFM pointe dans la direction Z lors de l'indentation lorsque la variation de hauteur de l'échantillon de surface est inférieure à 15 um-pour aider à surmonter ce défi. Les mesures sont réalisées à température ambiante, et non pas 37 ° C, donc les écarts dans les propriétés mécaniques causés par cette variation de température ne peut pas être évaluée, bien qu'ils seraient devrait être mineur. L'influence de l'architecture sous-jacente sur paroi alvéolaire observée propriétés mécaniques est difficile de déterminer avec la configuration actuelle microscopie optique. Par exemple, il serait souhaitable de déterminer si les parois alvéolaires présentent une anisotropie des propriétés mécaniques différentes et où en retrait dans des directions alignées ou transversale au plan du mur. Toutefois, les spécimens actuels sont épais et le système d'imagerie n'a pas les capacités 3D, il n'est donc pas possible de déterminer l'orientation du mur locales alvéolaires à chaque point de contact. Enfin, l'influence des constituants cellulaires sur les propriétés mécaniques mesurées reste à élucider. Dans les méthodes décrites ici, aucun effort n'est fait pour éliminer spécifiquement les constituants cellulaires des tissus. Cependant, les cellules présentes à la surface disponible pour l'indentation sont peu susceptibles d'être viable compte tenu du temps écoulé depuis la récolte des tissus et la nécessité de couper le tissu pour avoir accès à des alvéoles. Des expériences spécifiques pour enlever les cellules, ou repeupler les matrices de cellules viables, et d'évaluer les changements résultant de la rigidité des tissus semble justifiée.
Parce frais tissu non fixé est nécessaire pour ces mesures, le temps écoulé depuis la récolte des tissus à la mesure doit être minimisé et les échantillons doivent être conservés à 4 ° C pour éviter les changements de propriétés mécaniques. Une attention particulière devrait être accordée lorsque des bandes de tissu sont transférés entre les conteneurs pendant le lavage ou la coloration de sorte que la distorsion minimale ou le dommage est généré. Pour l'application AFM en liquide, une étape cruciale consiste à couper le tissu le plus plat possible et d'immobiliser l'échantillon sur la lamelle de soutien. S'il est disponible, une machine automatisée de sectionnement comme un vibratome ou trancheuse tissus peuvent être utilisés pour couper des tranches d'épaisseur très uniforme. Il est important d'attacher les bandes de tissu juste avant les mesures AFM et de minimiser le temps écoulé pour les mesures AFM que l'échantillon sera éventuellement détacher les lamelles. Une observation utile est que les grandes bandes semblent attacher plus stable pour couvrir les glissades et rester en place pendant des durées plus longues dans le PBS que les petites bandes.
Microindentation AFM peut caractériser les échantillons couvrant une large gamme de 100 Pa à 50 kPa (module de cisaillement) en utilisant un standard de 0,06 N / m en porte à faux avec une pointe de 5 pm de diamètre sphérique. Cette gamme peut être étendue en utilisant des sondes avec des constantes de ressort différentes; sondes AFM avec des conseils en verre sphérique allant de 0,6 à 12 um de diamètre et constantes du printemps allant de 0,01 à 0,58 N / m sont disponibles commercialement (par exemple NovaScan) et couramment utilisé 3. Avec une pointe de 5 um sphérique, la surface de contact théorique entre la pointe et de tissus est environ 5-9 um 2 pour 400-700 nm indentation (figure 1A). Conseils plus ou moins grande peut être utilisée pour fournir des échelles plus petites ou plus grandes de la résolution spatiale. Conseils pyramidal ont également été utilisés dans microindentation AFM 13-16, offrant des zones de contact plus petite et donc d'augmenter la résolution spatiale de la cartographie, mais pose des données est plus complexe pour ce géométrie de la pointe.
Plusieurs limites de cette méthode doit être noté. Le poumon a traditionnellement été caractérisé mécanique non invasive, par exemple en utilisant l'analyse pression-volume 17 ou punch-indentation des poumons entière 19,20. Les méthodes invasives telles que celle décrite ici de modifier l'architecture du poumon chez les façons importantes par la perte de l'int air-liquideerface qui existe normalement dans les poumons remplis d'air et la perte de pré-contrainte qui maintient l'inflation pulmonaire partielle à la relaxation des muscles respiratoires. Ces limitations sont communes à toutes les mesures effectuées dans les bandes du tissu pulmonaire 18. Notamment, cependant, la rigidité médiane mesurée dans le parenchyme du tissu pulmonaire normal (module de cisaillement ~ 0.5kPa) ne diffère pas sensiblement de ces estimations basées sur le poinçon-indentation des poumons intacts à des volumes de repos 19,20. Alors que le tissu pulmonaire est connu pour présenter non linéaire raidissement avec une déformation croissante, il n'est pas possible de tester de façon rigoureuse si cette propriété persiste jusqu'à l'échelle micro-avec les méthodes employées ici. Le modèle de Hertz suppose l'homogénéité de l'échantillon. Cependant, la plupart des matériaux biologiques, y compris du parenchyme pulmonaire, sont plus hétérogènes à diminuer les échelles spatiales. Hétérogénéité de l'échantillon peut entraîner des artefacts comme la variation du module d'Young en fonction de la profondeur d'indentation, c'est à dire en fonction de la couche ou un composant qui se déforme. L'hétérogénéité dans le plan xy peut être limitée en choisissant soigneusement la taille appropriée pointe sphérique en fonction de la microstructure du biomatériau tel que proposé par Dimitriadis EK et al. 8 Il est beaucoup plus difficile à prévoir ou à corriger les erreurs du modèle de Hertz grâce au matériau hétérogénéité dans la direction z. Azeloglu et al. a récemment proposé un modèle hybride de calcul afin de caractériser les propriétés élastiques du substrat hétérogène, avec des inclusions discrètes intégrées 21. Leur nouvelle technique offre un potentiel moyen de calculer les propriétés d'inclusion de matériaux hétérogènes surmonter les limites de l'analyse hertziennes.
Le modèle de Hertz suppose aussi absolue comportement élastique, tandis que les matériaux biologiques affichent généralement des comportements viscoélastiques dépendant du temps. Une caractérisation complète viscoélastiques du tissu peut être obtenu en faisant varier les vitesses d'indentation utilisé. Surtout, antérieure à macro-échelle essais mécaniques du tissu pulmonaire normal et fibrotique démontre la dépendance de fréquence faible des propriétés mécaniques du tissu pulmonaire, et la préservation des différences entre les propriétés des tissus normaux et fibrotiques mécaniques sur toutes les fréquences testées 11. Ces résultats suggèrent fortement que la mesure des propriétés mécaniques en utilisant une vitesse d'indentation simple avec l'AFM capte un aspect essentiel de l'évolution des propriétés mécaniques des tissus qui accompagnent la fibrose.
Le coefficient de Poisson de 0,4 pour les tissus pulmonaires utilisés dans ce travail est d'une mesure macroscopique 9. Malheureusement, le coefficient de Poisson au micro-échelle et des changements dans la condition la maladie ne sont pas disponibles dans la littérature. Comme alternatives à E, E / (1-υ 2) ou (1-υ 2) / πE (notée k constante élastique) 22 peut être calculée à partir de microindentation AFM et signalé lorsque le coefficient de Poisson est inconnue. Pour la plupart des biomatériaux coefficient de Poisson est dans la gamme de 0,4 à 0,5 en raison de leur forte teneur en eau. Dans la gamme de 0,3 à 0,5, le facteur 1 / (1-υ 2) ne varie que de 1,10 à 1,33, tels que les variations raisonnables dans le coefficient de Poisson d'exercer que des effets modestes sur le module rapporté. L'augmentation du module de cisaillement que nous rapportons à un parent tissu fibreux au tissu normal est de plusieurs fois l'ampleur, ce qui implique que les erreurs associées à des variations dans le coefficient de Poisson sont mineures par rapport à l'évolution des propriétés mécaniques observées.
L'algorithme réelle et le code qui peut être utilisé pour l'analyse de la force-déplacement des données est soumise à la condition d'application spécifique et des caractéristiques suivantes des diverses populations des courbes force-déplacement. Si une analyse plus sophistiquée est d'un intérêt, on peut consulter les travaux de Lin et coll. 23. Les auteurs ont compilé une série de stratégies synergiques dans un algorithme qui permet de surmonter bon nombre des complications qui ont déjà entravé les efforts déployés pour automatiser le montage de modèles de données Hertz indentation.
Plusieurs autres secteurs sont disponibles pour le développement ultérieur et l'exploitation de cette méthode. Dans les cas où l'on s'intéresse à la visualisation des parois alvéolaires, sans marquage de l'anticorps, à la fois élastine et de collagène peut être visualisé à partir de leur signal d'autofluorescence dans le spectre vert. D'autre part, une meilleure image, en utilisant soit des coupes de tissus plus fins, les techniques d'imagerie 3D, ou les deux, pourrait améliorer la capacité à corréler avec les sous-tendent l'architecture du tissu des propriétés mécaniques. Bien que les méthodes actuelles permettent la coloration et la visualisation des composants de la matrice extracellulaire comme le collagène et la laminine, des efforts supplémentaires pourraient être destinées à coloration marqueurs de surface cellulaire pour identifier les populations spécifiques de cellules et de caractériser les micro-environnements mécaniques dans le voisinage de ces populations. Alternatively, tissus pourraient être récoltés à partir des souris exprimant marqués par fluorescence lignée cellulaire des marqueurs ou des protéines spécifiques de poursuivre le même objectif. Enfin, la méthode détaillée apparaît ici bien adaptée à la caractérisation d'autres caractéristiques anatomiques dans les poumons, comme les navires qui remodelage dans l'hypertension, et les voies respiratoires, qui remodelage dans l'asthme. Basé sur son état de développement actuel et le potentiel d'améliorer encore, microindentation AFM semble prête à donner des aperçus précieux sur les changements dans la rigidité des tissus qui accompagnent la progression de la maladie dans le poumon, et sera sans aucun doute de la valeur pour caractériser les changements spatiaux et temporels dans la la rigidité d'une variété d'autres tissus mous.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions A. Tager et B. Shea pour leur collaboration continue, et de fournir le tissu pulmonaire utilisés à des fins de démonstration ici. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde HL-092961. Ce travail a été exécuté en partie au Centre de systèmes de taille nanométrique (SNC), un membre du Réseau National Nanotechnology Infrastructure, qui est soutenu par la National Science Foundation en récompense NSF ECS-0335765. SNC est une partie de la Faculté des arts et des sciences à l'Université Harvard.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |