Styvheten i den extracellulära matrisen påverkar i hög grad flera beteenden från tillhörande celler. Matrix styvhet varierar rumsligt under en vävnad, och genomgår förändring i olika sjukdomstillstånd. Här utvecklar vi metoder för att karakterisera rumsliga variationer i stelhet i normal och fibrotiska mus lungvävnad med hjälp av atom mikrointryckt kraft mikroskopi.
Matrix styvhet påverkar starkt tillväxt, differentiering och funktion av vidhäftande celler 1-3. På makroskala styvheten i vävnader och organ i kroppen spänner över flera storleksordningar 4. Mycket mindre är känt om hur styvheten varierar rumsligt i vävnader, och vad omfattningen och rumslig skala av stelhet förändringar i sjukdomens processer som resulterar i vävnaden ombyggnad. För att bättre förstå hur förändringar i matrisen styvhet bidrar till cellulär fysiologi vid hälsa och sjukdom, är mätningar av vävnad styvhet erhålls vid en rumslig skala relevant bosatt celler behövs. Detta gäller särskilt för den lunga, en mycket kompatibel och elastisk vävnad där matrisen remodeling är ett framträdande inslag i sjukdomar som astma, emfysem, högt blodtryck och fibros. Att karakterisera den lokala mekaniska miljö lungparenkym på en rumslig skala är relevant för bosatta celler, har vi utvecklat metoder att direkt mäta den lokala elastiska egenskaper av färska murina lungvävnad med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM) mikrointryckt. Med lämpligt val av AFM indentor, grenställ och indrag djup, dessa metoder möjliggör mätningar av lokala modul vävnad skjuvning parallellt med fas kontrast och fluorescens avbildning av regionen av intresse. Systematisk provtagning av vävnad remsor innehåller kartor över vävnad mekaniska egenskaper som avslöjar lokala rumsliga variationer i skjuvstyrka. Samband mellan mekaniska egenskaper och bakomliggande anatomiska och patologiska funktioner illustrerar hur styvheten varierar med matris deponering i fibros. Dessa metoder kan utsträckas till andra mjuka vävnader och processer sjukdom att avslöja hur de lokala vävnaden mekaniska egenskaperna varierar mellan utrymme och sjukdomsutveckling.
Mekanisk karakterisering av lungvävnad med hjälp av AFM mikrointryckt erbjuder oöverträffad rumslig upplösning (bild 4), vilket ger ett unikt perspektiv på mikroskala variationer i vävnaden styvhet. Som ett exempel på dess användbarhet uppgav tidigare makronivå mätningar i normal och fibrotiska band lungvävnad en ungefärlig 2-3-faldig ökning av elastance med fibros 11,12. Däremot avslöjar AFM mikrointryckt att vävnaden hårdnande är mycket lokal, med vissa regioner uppvisar upp till ~ 30-faldig ökning av skjuvmodulen över medianvärdet sågs hos normala lungvävnad 10. Eftersom matrisen styvhet är nu känt att kritiskt påverka cellens funktion, dessa lokala mätningar ge ovärderlig parametrar för att öka biofidelity av cellkulturens studie av lungceller.
Flera praktiska frågor uppstår med hjälp av tunna remsor av lungvävnad. Ytorna av remsorna inte är helt slät, eftersom vävnaden profilen följer arkitekturen i den underliggande alveolerna. AFM-systemet justerar automatiskt spets position i Z-riktning under indrag när provet ytan höjd variation är mindre än 15-ìm att hjälpa till att övervinna denna utmaning. Mätningarna görs vid rumstemperatur, inte 37 ° C, så avvikelser i mekaniska egenskaperna orsakas av denna variation i temperaturen kan inte utvärderas, men de kan förväntas vara liten. Inverkan av den underliggande alveolära väggen arkitektur på observerade mekaniska egenskaper är svårt att avgöra med den nuvarande ljusmikroskop setup. Till exempel skulle det vara önskvärt att avgöra om alveolära väggar uppvisa anisotropi och olika mekaniska egenskaper när indragen i en riktning i linje med eller vinkelrätt mot plan vägg. Men den aktuella proverna är tjocka och bildsystem inte har 3D-funktioner, därför är det inte möjligt att avgöra den lokala alveolära väggen inriktning på varje kontaktpunkt. Slutligen är påverkan av cellulära beståndsdelar på uppmätta mekaniska egenskaper inte helt klarlagd. I de metoder som beskrivs här, finns inga ansträngningar för att specifikt ta bort cellulära beståndsdelar i vävnaden. Men, de celler som finns på ytan tillgänglig för indrag är förmodligen inte lönsamt med tanke på den tid som förflutit sedan vävnad skörd och nödvändigheten av att skära av vävnad för att få tillgång till alveolerna. Särskilda experiment för att ta bort celler, eller återbefolka matriser med livskraftiga celler och utvärdera den resulterande förändringar i vävnaden styvhet verkar befogad.
Eftersom färska ofixerade vävnad som krävs för dessa mätningar, bör den tid som förflutit från vävnad skörd till mätning minimeras och prover ska förvaras vid 4 ° C för att undvika ändringar i mekaniska egenskaper. Särskild uppmärksamhet bör ägnas när vävnad remsor överförs mellan behållare under tvättprogrammet eller färgning så att minimal distorsion eller skada uppstår. För AFM ansökan i flytande form, är ett viktigt steg för att skära i vävnaden så platt som möjligt och immobilisera provet på den stödjande täckglas. Om möjligt kan en automatisk sektionering maskin som en vibratome eller vävnad slicer användas för att skära skivor av mycket jämn tjocklek. Det är viktigt att fästa vävnad remsor omedelbart före AFM mätningar och minimera den tid som förflutit för AFM mätningar som provet kommer så småningom lossnar från täckglas. En användbar iakttagelse är att större band verkar fästa mer stabilt för att täcka glider och förblir på plats för längre löptider i PBS än mindre remsor.
AFM mikrointryckt kan karakterisera prover som spänner över ett brett spektrum från 100 Pa till 50 kPa (skjuvmodulen) när du använder en vanlig 0,06 N / m fribärande med en 5 ìm diameter sfärisk spets. Detta intervall kan utökas med hjälp av prober med olika fjäder konstanter, AFM sonder med sfäriska glas tips som sträcker sig från 0,6 till 12 mikrometer i diameter och våren konstanter som sträcker sig från 0,01 till 0,58 N / m finns kommersiellt tillgängliga (t.ex. Novascan) och vanliga 3. Med en 5 ìm sfärisk spets, är den teoretiska kontaktytan mellan spetsen och vävnad ca 5-9 ìm 2 för 400-700 nm indrag (Fig. 1A). Mindre eller större tips kan användas för att ge mindre eller större skala av rumsliga upplösning. Pyramidal tips har också använts i AFM mikrointryckt 13-16, vilket ger mindre kontakt med områden och därmed öka rumsliga upplösningen i kartläggningen, även om uppgifterna montering är mer komplex för detta tips geometri.
Flera begränsningar med denna metod bör noteras. Lungan har traditionellt varit mekaniskt präglats icke-invasivt, till exempel med hjälp av tryck-volym analys 17 eller punch-indrag av hela lungorna 19,20. Invasiva metoder såsom den som beskrivs här förändrar lungan arkitekturen i viktiga sätt genom förlusten av luft-vätske interface som normalt finns i luftfyllda lungor och förlusten av pre-stress som håller lungan delvis inflation på avslappning av andningsmuskulaturen. Dessa begränsningar är gemensamma för alla mätningar som gjorts i remsor lungvävnad 18. Noterbart är dock medianen styvhet som mäts i parenkymet av normal lungvävnad (skjuvmodulen ~ 0.5kPa) inte skiljer sig väsentligt från beräkningar baserade på punch-indrag av intakta lungorna vid vila volymer 19,20. Medan lungvävnad är känd för att uppvisa icke-linjära hårdare med ökande deformation, är det inte möjligt att testa på ett rigoröst sätt om denna fastighet kvarstår ner till mikro-skala med de metoder som används här. Hertz Modellen förutsätter homogenitet provet. Men de flesta biologiska material, inklusive lungparenkym, alltmer heterogena till minskande rumsliga skalor. Heterogenitet av provet kan resultera i artefakter som variant av Youngs modul beroende på indrag djup, dvs beroende på lagret eller komponent som är deformeras. Olikheter i XY-planet kan begränsas genom att noggrant välja lämplig sfärisk spets storlek beroende på mikrostruktur biomaterial som föreslagits av Dimitriadis EK et al. 8 Det är mycket svårare att förutsäga eller korrigera Hertz modell felet beror på materialet heterogenitet i z-riktningen. Azeloglu et al. föreslog nyligen en hybrid beräkningsmodell att karakterisera de elastiska egenskaperna hos heterogena substrat med diskret inbyggda inneslutningar 21. Deras nya teknik ger en möjlighet att beräkna integrationen egenskaper hos heterogena material övervinna begränsningarna i Hertz'skt analys.
Hertz Modellen förutsätter också absolut elastiskt beteende, medan biologiska material normalt visa tidsberoende viskoelastiska beteenden. En fullständig viskoelastiska karakterisering av vävnad kan erhållas genom att variera indrag används hastigheter. Viktigt, visar tidigare makronivå mekanisk provning av normal och fibrotiska lungvävnad svaga frekvens beroende av mekaniska lungvävnad egenskaper, och bevarande av skillnaderna mellan normal och fibrotiska vävnaden mekaniska egenskaper i alla frekvenser testade 11. Dessa fynd tyder starkt på att mätning av mekaniska egenskaper med en enda inbuktning hastighet med AFM fångar en viktig aspekt av den förändrade vävnaden mekaniska egenskaper som följer fibros.
Den Poissons tal på 0,4 för lungvävnad som används i detta arbete är från en makroskopisk mätning 9. Tyvärr Poissons tal på mikro-skala och eventuella förändringar i sjukdomstillstånd är inte tillgängliga i litteraturen. Som alternativ till E, E / (1-υ 2) eller (1-υ 2) / πE (betecknas den elastiska konstanten k) 22 kan beräknas AFM mikrointryckt och rapporteras när Poissons tal är okänt. För de flesta biomaterial Poissons tal är i intervallet 0,4 till 0,5 på grund av deras höga vattenhalt. Inom intervallet 0,3-0,5 varierar faktorn 1 / (1-υ 2) Endast 1,10 till 1,33, så att rimliga variationer i Poissons tal utövar endast måttliga effekter på de rapporterade modul. Ökningen skjuvmodulen att vi rapport för fibrotiska vävnaden jämfört med normal vävnad är flera gånger i storlek, vilket innebär att fel i samband med variationer i Poissons tal är små i förhållande till förändringar av mekaniska egenskaper observeras.
Själva algoritmen och kod som kan användas för analys av kraft-förskjutning uppgifter är föremål för den specifika applikationen skick och den efterföljande egenskaper olika populationer av kraft-förskjutning kurvor. Om mer sofistikerad analys är av intresse, kan man höra verk av Lin et al. 23. Författarna sammanställt en rad samverkande strategier till en algoritm som övervinner många av de komplikationer som tidigare har hindrat ansträngningarna för att automatisera montering av Hertz modeller av indrag data.
Flera andra områden är tillgängliga för vidare utveckling och utnyttjande av denna metod. I de fall man är intresserad av att visualisera den alveolära väggar utan antikroppar märkning kan både elastin och kollagen visualiseras från deras autofluorescent signal i det gröna spektrumet. Å andra sidan kan bättre bildbehandling, antingen med tunnare vävnadssnitt, 3D avbildningstekniker, eller båda, öka förmågan att korrelera vävnad arkitektur med underliggande mekaniska egenskaper. Medan de nuvarande metoderna möjliggör färgning och visualisering av extracellulär matrix komponenter såsom kollagen och laminin, skulle ytterligare ansträngningar som syftar till färgning markörer cellytan för att identifiera specifika cellpopulationer och för att karakterisera den mekaniska mikromiljöer i närheten av sådana populationer. Alternatively kan vävnad tas ut från möss som uttrycker fluorescerande-märkta härstamning markörer eller cellen specifika proteiner att sträva efter samma mål. Slutligen, den metod som beskrivs här verkar väl lämpad att karakterisera andra anatomiska drag i lungan, till exempel fartyg som remodel vid hypertoni, och luftvägar vilket remodel vid astma. Utifrån sin nuvarande utveckling och potential för ytterligare förbättringar, verkar AFM mikrointryckt redo att ge värdefulla insikter i de förändringar i vävnaden styvhet som följer med sjukdomsprogression i lungan, och kommer utan tvekan att vara av värde i karakterisera rumsliga och tidsmässiga förändringar i styvhet en mängd andra mjuka vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar A. Tager och B. Shea för deras fortsatta samarbete och för att ge lungorna används för demonstration här. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag HL-092.961. Detta arbete utfördes delvis vid Centrum för Nanoscale Systems (CNS), en medlem av National Nanotechnology Infrastructure Network, som stöds av National Science Foundation i NSF utmärkelse ECS-0.335.765. CNS är en del av Filosofiska fakulteten vid Harvard University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |