De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Summary

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te bereiden

Abstract

Drosophila is lange tijd gebruikt als modelsysteem om ontwikkeling te bestuderen, vooral te danken aan het gemak waarmee het genetisch handelbaar. In de loop der jaren, hebben een overvloed aan gemuteerde stammen en de technische trucs ontwikkeld om ingewikkelde vragen worden gesteld en beantwoord in een redelijke hoeveelheid tijd. Fundamenteel inzicht in het samenspel van onderdelen van alle bekende grote signaalwegen is verkregen in voorwaartse en omgekeerde genetische Drosophila studies. De vlieg oog heeft bewezen uitstekend geschikt zijn voor mutatie-analyse, omdat, onder laboratoriumomstandigheden, vliegen kan overleven zonder functionele ogen. Bovendien is het oppervlak van het insect oog bestaat uit zo'n 800 individuele eenheid ogen (facetten of ommatidia) die een regelmatige, glad oppervlak vormen wanneer bekeken onder een microscoop dissectie. Zo is het gemakkelijk om te zien of er een mutatie zou kunnen ogen ontwikkeling of groei beïnvloeden door extern op zoek naar het verlies van de gladde oppervlak ('ruw eye' fenotype, Fig 1.) Of de totale grootte van het oog, respectievelijk (voor voorbeelden van schermen op basis van externe oog morfologie zie bijv. ^1). Latere gedetailleerde analyses van het oog van fenotypes nodig fixatie, plastic inbedding en dunne-snijden van de volwassen ogen.

De Drosophila oog ontwikkelt zich uit de zogenaamde eye verbeelding schijf, een zak van epitheliale cellen die prolifereren en differentiëren tijdens het larvale en popstadium fases (voor review zie bv ^2). Elk ommatidium bestaat uit 20 cellen, waaronder acht fotoreceptoren (PR of R-cellen. Fig. 2), vier lens-afscheidende kegel cellen, pigment cellen ('zeshoek' rond R-cell cluster) en een varkenshaar. De fotoreceptoren van elke ommatidium, het meest gemakkelijk te herkennen door hun lichtgevoelige organellen, de rhabdomeres, zijn georganiseerd in een trapezium bestaande uit de zes "buitenste" (R1-6) en twee 'innerlijke' fotoreceptoren (R7 / 8; R8 [Fig 2.] is onder R7 en dus alleen gezien in de paragrafen uit diepere delen van het oog). De trapezium van elk facet is precies afgestemd op die van haar buren en de algemene achterwaartse en dorsoventral assen van het oog (Fig. 3A). Met name de ommatidia van de dorsale en ventrale (zwarte en rode pijlen, respectievelijk) helften van het oog zijn spiegelbeelden van elkaar en komen overeen met twee chirale vormen vastgesteld tijdens planaire celpolariteit signalering (voor review zie bijv. ^3).

De methode om semi-dunne eye secties te genereren (zoals die voorgesteld in Fig. 3) die hier beschreven is enigszins gewijzigd van de ene oorspronkelijk beschreven door Tomlinson en Ready ^4. Het laat de morfologische analyse van alle cellen, behalve voor de transparante kegel cellen. Daarnaast kan het pigment van de R-cellen (blauwe pijlen in Fig. 2 en 3) gebruikt worden als een cel-autonome marker voor het genotype van een R-cel, waardoor genetische eisen van de genen in een subset van R-cellen kunnen eenvoudig worden bepaald ^5,6.

Protocol

1. Vlieg hoofd dissectie

1. Zorg ervoor dat u alle materialen bij de hand (met inbegrip van gelatine gecoate glaasjes). Bereid glutaaraldehyde en Osmium fixatieven (zie hieronder). Per genotype te verankeren, aliquot 200μl glutaaraldehyde fix oplossing in 1,5 ml buizen op ijs.
2. Verdoven vliegen aan de CO ₂ pad (we meestal te ontleden zeven vliegen hoofden tot zes insluiten per genotype in het geval een hoofd is vernietigd tijdens de procedure).
3. Houden en iets hoger druk op de borstkas van de vlieg-, rug-zijde, met een pincet en gebruik een scherpe scalpel af te snijden het hoofd.
4. Het stabiliseren van de vlieg hoofd door het aanraken van de hals met het pincet en zorgvuldig slice off een klein deel van een oog. Dit verhoogt de penetratie van het fixatief (als u van plan bent uw oog secties te gebruiken voor klonale analyse, snijd het oog met geen of kleinere klonen). Vermijd het aanraken en beschadiging van de intacte oog, dat later zal worden coupes.
5. Raak het hoofd met een pincet of het scalpel op het oppervlak van de cut-off oog en breng het hoofd in glutaraldehyde / fosfaat fixatief op ijs (de hoofden vaak drijven op de top van het fixatief) De ontlede koppen mag niet worden bewaard in glutaaraldehyde vast voor langere dan 15 minuten voor de toevoeging van Osmium. Herhaal stap 1.2-1.5 met de andere vliegen van hetzelfde genotype.

2. Fixatie en inbedding (gebruik handschoenen voor alle stappen!)

1. Spin de flyheads in Eppendorf centrifuge gedurende 1 minuut bij 10.000 rpm. Blijven, zelfs als hoofden niet zinken.
2. Voeg 200μl van OSO ₄ oplossing en fix voor ten minste 30 minuten en maximaal een uur op het ijs.
3. Met behulp van een Pasteur pipet, verwijder dan de glutaaraldehyde / Osmium-oplossing (zorg ervoor dat de juiste afvalverwerking procedures te gebruiken!) En te vervangen door 200μl Osmium oplossing. Incubeer op ijs voor 1-6 uur. Zorg altijd dat de koppen zijn volledig bedekt met vloeibare en nooit verwijder alle van de oplossing als de hoofden of de ogen zou kunnen instorten!
4. Met behulp van een Pasteur pipet, gooi fixatief, voeg 0,5-1ml 30% ethanol en incubeer gedurende ten minste 5 minuten op ijs (zorg ervoor dat de juiste afvalverwerking procedures te gebruiken omdat de ethanol bevat nu Osmium!).
5. Herhaal de bovenstaande stap met 50%, 70%, (80%), 90% en tweemaal 100% ethanol. Onder de 80% ethanol stap over als het gebruik van de ogen voor elektronen microscopische analyse. Na de 70% wasstap, kunnen de monsters worden verwijderd uit het ijs.
6. Vervang de ethanol met een gelijk volume van propyleenoxide (vluchtige, blijven werken in de kap). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
7. Herhaal propyleenoxide te wassen. Werk in batches, indien de verwerking van een groot aantal genotypes in parallel om te voorkomen dat instorten van de ogen als gevolg van verdamping van het propyleen oxide.
8. Verwijder het merendeel van de propyleenoxide en met behulp van een plastic transferpipet, voeg ongeveer 500μl van een 1:1 hars: propyleenoxide oplossing. Evenwicht 's nachts bij kamertemperatuur.

3. Inbedding en regeling in mallen

1. Zorg ervoor dat alle schimmels zijn gelabeld om spoor van uw verschillende genotypen te houden, vul dan de vormen met 100% hars. Vul niet te veel (geen 'hoge heuvels' over het oppervlak van de mallen bij het zoeken dwars door het matrijsoppervlak). Gebruik harde hars voor EM analyse.
2. Met behulp van een transferpipet, verwijder dan de 50% hars van de koppen, te vervangen door 100% hars, en incubeer gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur. Als hoofd worden geïnfiltreerd met hars, zullen ze zinken naar de bodem van de buis.
3. Met behulp van een tandenstoker die is hit op een hard oppervlak eenmaal op een kleine haak te creëren, de overdracht een hoofd op het moment dat in een mal.
4. Leg aluminiumfolie op het werkgebied van uw ontleden mogelijkheden om het te beschermen tegen de hars morsen.
5. Met behulp van een dissectie naald en zoekt al uw bereik ligt, wervelen de kop een beetje in de hars en zorgvuldig te verplaatsen naar de onderkant van de mal dicht bij het puntige uiteinde.
6. Lijn het oppervlak van het intacte (!) Oog (of uw toekomstige snijden het vliegtuig als je wilt doorsnede hebben) de hals naar beneden met de voorste wand van de mal, en zorg ervoor dat de tangentiële oppervlak van het oog ongeveer een half hoofd te houden diameter uit de buurt van de mal muur. In zeldzame gevallen, een oog instortingen die kan worden gezien als een lege ruimte tussen het oogoppervlak en het hoofd cuticula. Als je een ingestort oog, vervang deze dan met de 7 ^e reserve-oog.
7. Herhaal dit met alle hoofden. Eenmaal gedaan met alle uitlijningen, re-check alle ogen om ervoor te zorgen dat ze bewoog niet toen u de naald uit de hars.
8. Als je problemen hebt met de ogen bewegen als het verwijderen van de naald ontleden, de positie van de ogen zoals gewenst, snel intrekken van de naald een beetje uit de buurt van het hoofd en dan langzaam volledig verwijderen van de naald.
9. 'S nachts Bak de schimmels bij 70 ° C.

4. Trimmen en snijden

1. Verwijder de verharde blokken van de mallen door het buigen van de mallen, keeping spoor van welk blok komt overeen met die genotype (bv op te slaan in kleine scintillatieflesjes).
2. Voor het trimmen, gebruik van een klauwplaat geschikt is voor uw microtoom dat gemonteerd is open op een blok van plexiglas of aluminium. Monteer het blok te trimmen, het oog omhoog, in de boorkop.
3. Onder de dissectie bereik met behulp van een Teflon coating scheermes beval, voorzichtig afgesneden alleen de bovenste laag van je blok. Dit laat een duidelijke ondergrond maar die moet u het oog te zien en kan dus de toekomst voorspellen vlak van snijden. Vermijd het snijden van uw vingers!
4. Snijd overtollig plastic aan beide zijden van het hoofd en aan de voorkant (dat wil zeggen wat vroeger naar de top van de mal worden bij het uitlijnen van de ogen) tot het grootste deel van het plastic rond het hoofd is afgesneden. Het beste is om het hoofd langzaam benadering door het afsnijden van meerdere dunne lagen plastic.
5. Met behulp van een schoon scheermesje, verwijder voorzichtig dunne lagen van de bovenkant van het oog in de exacte vliegtuig dat u wilt verderop (meestal tangentiaal aan het oog, onder een lichte hoek naar de originele mal oppervlak).
6. Ga door totdat je gewoon beginnen weg te snijden de buitenkant van het oog. Zorg ervoor dat u schone gebieden van het blad tot een glanzende, transparante oppervlak, waardoor afstemming maakt in de microtoom makkelijker te verkrijgen.
7. Om te besparen op scheermesjes, gebruik van oudere bladen voor de ruwe trimmen rond de zijkanten van het blok en gebruik een nieuw blad voor de fijne trimmen (eerste snede en 4.6). Op het einde heb je een driezijdige piramide met een licht gekanteld, cut-off top die overeenkomt met uw toekomstige sectie vliegtuig.
8. Monteer het blok in de microtoom. De werkelijke snijden is afhankelijk van het type microtoom en zal niet in detail beschreven hier. We maken gebruik van een Sorvall MT5000 met een histo kwaliteit diamant mes om 0,5 tot 1 uM delen te snijden. Voor lichte microscopische analyse, doe lichte variaties in paragraaf dikte van niet meer toe. Als snijden klonen gekenmerkt door een White + transgen, sectie 1 uM secties om te zorgen voor voldoende pigment korrels naast de rhabdomeres per sectie (afb. 2) hebben.
9. Secties zullen drijven op het water. Lift eerste 20 tot 30 secties met een afgeplat uiteinde van een houten Q-tip van onder het wateroppervlak in een draaiende beweging en dragen ze in een druppel water op een gelatine gecoat glas dia (bewaard op een verwarmingsplaat rond 100 ° C ).
10. Herhalen met een andere 20-30 secties. Wacht tot het water is verdampt en secties vasthouden aan de dia. Meestal delen van drie ogen gerangschikt in drie kolommen (drie ogen) door twp rijen (boven / onder secties) past goed op een dia.

5. Vlekken en microscopische analyse

1. Tenzij snijden klonen, beits secties. Plaats slide met secties op een set verwarmingsblok op 90 ° C. Verdeel Toluidine-blauwe vlekken oplossing van een 30 ml injectiespuit bevestigd aan een 0.22μm filter op de glijbaan en vlek gedurende 10 seconden. Onmiddellijk uitgebreid spoelen met gedestilleerd water. De lucht drogen.
2. Met behulp van een plastic transferpipet, te distribueren 3 druppels DPX montage medium op de glijbaan en bedek met een dekglaasje aan. Top met 3 dubbeltjes en laat de montage medium hard (bijvoorbeeld 's nachts bij kamertemperatuur).
3. Beeld met een lichtmicroscoop. Gebruik een 5x of 10x lens om een ​​goede sectie te vinden en vervolgens naar een 63x olie-immersie lens schakelaar voor gedetailleerde analyse en fotograferen. We meestal gebruik van fase-contrast-instellingen, maar donkerveld optiek zo goed werkt.

6. Representatieve resultaten:

Meestal zijn ogen ingebed in kunststof voor een gedetailleerde analyse van de externe ruwe oog fenotypes gedetecteerd als onderdeel van een genetische screen of in het proces van het testen van genetische interacties met genen waarvan bekend is of algemene oogstructuur of polariteit beïnvloeden. Typische resultaten van de ogen secties zijn weergegeven in figuur 3. Wild-type ommatidia (Fig. 3A) tonen de volledige fotoreceptor te vullen, omgeven door een rooster van pigmentcellen. In tegenstelling, in een strabismus (stbm, alias van-gogh ⁷⁾ mutant, de ommatidial polariteit is verloren en, hoewel de volledige fotoreceptor complement aanwezig is, rotatie en chiraliteit zijn gerandomiseerde (Fig. 3B). Aangezien de stbm allel doorsnede was in aw ^- achtergrond, zijn de pigmentkorrels ontbreekt in Fig. 3B. Figuur 3C toont een voorbeeld van een klonale analyse. Drosophila Rho kinase (Drok) is vereist voor ommatidial rotatie als voor de structurele integriteit van het oog ^8. Homozygote Drok ^twee klonen kunnen worden geïdentificeerd door de afwezigheid van pigment in de pigmentcellen en de rhabdomeres (typisch, zijn klonen geïnduceerd met behulp van eyeless-Forever en een P-element met een sterk uitgesproken witte marker-gen aanvulling op een achtergrond w ^- mutatie in het wild -type en heterozygote weefsel). Het is dus mogelijk om mutant op te sporen door hun gebrek aan pigment. Als gevolg van de cel-autonomie van de pigmentatie in de R-ceLLS eerder genoemde, genotypen van individuele O-cellen kan worden vastgesteld (zie de pijlen in Fig. 3C).

Figuur 1. Drosophila oog is een uitstekend modelsysteem voor biologen, omdat, in tegenstelling tot het gladde oppervlak van een wild-type eye (A), het oppervlak van een mutant oog is extern vaak ruw (B), indicatief van onderliggende oog fenotypes . In alle figuren, anterior is naar links en dorsale om is. Foto's Met dank aan Dr Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA.

Figuur 2. Light microscopische beelden van enkele ommatidia coupes met behulp van de beschreven methode. Slechts zeven R-cellen zichtbaar zijn op een moment per ommatidium, omdat R7 ligt op de top van de R8. (A, A ') op de R7-niveau, is de cel lichaam van R7 geconstateerd tussen R1 en R6 (gele pijl in A'). In tegenstelling, op de R8-niveau (B), is de cel lichaam van R8 geconstateerd tussen R1 en R2 (gele pijl in B '). Blauwe pijlen markeren de pigmentkorrels die gebruikt kunnen worden als een cel-autonome pigment marker.

Figuur 3. Tangentiële secties door middel van wild-type (A), stbm (B) en Drok (C) mutant volwassen Drosophila ogen. Schema's onder de secties geven de polariteit van ommatidia (zie (A) voor de pijlen). Cirkels vertegenwoordigen ommatidia met defecten in de afdrukband te vullen. Gele lijnen geven de dorsale / ventrale lijn van symmetrie (evenaar). In tegenstelling tot de goed georiënteerde ommatidia van wild-type (A), is de vlakke organisatie verloren in de stbm mutant (B). Merk op dat het gedeelte van de stbm mutant getoond mist pigment als gevolg van de w ^- mutant achtergrond. (C) Omdat Drok mutaties zijn dodelijk, moeten ze worden geanalyseerd in klonen. Zo, gepigmenteerde cellen zijn wild-type of heterozygoot (gevulde blauwe pijlpunten), terwijl R-cellen ontbreekt pigment (open blauw pijlpunten) zijn homozygoot mutant. Naast de rotatie gebreken, Drok mutanten ook vertonen structurele gebreken, met inbegrip ontbrekende of overtollige nummers van R-cellen. Merk op dat voor klonale analyse, de secties niet gekleurd om te voorkomen dat het zicht op de pigmentkorrels.

Discussion

Met behulp van Drosophila als modelorganisme, genetische screens geleid tot de identificatie van veel van de stichtende leden van genfamilies essentieel zijn voor het grootste deel van de sterk geconserveerde signaalwegen in hogere eukaryoten inclusief de mens. Aangezien onder laboratoriumomstandigheden, een functioneel oog is overbodig om te overleven, het oog is een bijzonder goed geschikt weefsel voor de ontdekking van nieuwe genen functies en de beoordeling van de genetische netwerken. Ultrastructurele analyse van de vlieg oog met behulp van de beschreven methode dus geleid tot fundamentele ontdekkingen relevant zijn voor ontwikkeling en ziekte. Aanvankelijk werd enkele cel klonale analyse uitgevoerd met behulp van X-ray veroorzaakte klonen in combinatie met bekende nauw verbonden cel-autonome recessieve markers. Meer recent is de beschikbaarheid van de FLP / FRT systeem om klonen te genereren aanzienlijk vergemakkelijkt de fenotypische analyse van de dodelijke mutaties in het oog van secties ^6,9.

Analyse van de ogen delen is niet beperkt tot tangentiële secties hier beschreven. Indien gewenst, kan de koppen worden uitgelijnd in elke richting in de matrijzen en dwarsprofielen kunnen worden verkregen naar diepere lagen in het hoofd, zoals de lamina en merg te bestuderen. Het protocol hier beschreven is dus een veelzijdige methode voor analyses van het oog en hoofd structuren Drosophila volwassenen.

Materials

General equipment: For general fly husbandry see 10 Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands. CO2 Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection. Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO4x 12 H2O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH2O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight. Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose). Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work. Fixation solutions: Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice. Osmium solution: 2% OsO4 in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice. Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette. Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use. Staining solution: 1% Toluidine-blue in 1% Borax. Soft Hard Resin A 54g 50g Hardener B 44.5g 50g Accelerator C 2.5g 1.75g Plasticizer D 10g 0.75g Table 1. Resin preparation To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol. Reagent Supplier Catalog number Fly pad e.g. Genesee 59-119 Glutaraldehyde Sigma G7526-10 X 10 ML OsO4 Polysciences,Inc. 0972A-20 Propyleneoxide Fisher 04332-1 Scalpel handles, for #3 Fisher 22080046 Scalpel blades #11 Fisher 08-916-5B Transfer pipettes Fisher 13-711-7M Durcupan (R) ACM resin Sigma (Fluka) 44610-1EA Steel dissecting needle Fisher S17346 BEEM flat embedding mold Electron Microscopy Sci. 70904-12 Teflon coated razor blades Electron Microscopy Sci. 71970 Q-tip (sterile swabs) Fisher 14-959-81 Glass slides Fisher 12-550-143 Cover slips No 1, 22X60 mm Fisher 12-531K Gelatin Fisher ICN96010280 Cr(III) K SO4 dodecahydrate Sigma 243361 Diamond Histo knife, 6mm Diatome US 60-His Toluidine Blue O Fisher BP107-10 Borax (Na-Tetraborate) Fisher AC20629-1000 DPX mounting medium Sigma 44581-100ML Table 2. Materials