Biofilm ניתוח שבעל פה של Palatal expanders על ידי הכלאה ב-situ פלואורסצנטי מיקרוסקופיה Confocal סריקת לייזר

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מבניים ההלחנה של biofilm אוראלי טבעי עם מכשירים אורתודונטים<em> באתרו</emהכלאה> (FISH) ו מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM). דגימות biofilm אוראלי נאספו palatal expanders, גירוד, שרף אקרילי פתיתי את פני השטח שלהם ומתייחסים אליהם לעיבוד מולקולרית.

Abstract

לייזר Confocal מיקרוסקופיית (CLSM) של biofilm הטרוגנית טבעית היום בהנחייתם של מגוון רחב של טכניקות צביעה, אחד מהם הוא הקרינה הכלאה באתרו (FISH). ^1,2 ביצענו מחקר פיילוט שבו דגימות biofilm אוראלי שנאספו קבוע מכשירי אורתודונטי (palatal expanders) הוכתמו על ידי דגים, המטרה להיות כדי להעריך את הארגון התלת מימדי של biofilm טבעי הצטברות פלאק. ^3,4 דגים יוצר הזדמנות להכתים תאים בסביבה biofilm האם שלהם על ידי שימוש 16S שכותרתו fluorescently rRNA במיקוד בדיקות. ^4-7,19 לעומת טכניקות חלופיות כמו תיוג immunofluorescent, זוהי טכניקה זולה, וסימון מדויק וישיר לחקור קבוצות חיידקים שונים קונסורציומים biofilm מעורבת. ^18,20 בדיקות כלליות שימשו אשר נקלטות על ידי Eubacteria ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; להלן EUBmix), ^8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. LGCmix להלן), ^9,10 ו Bacteroidetes (Bac303) ¹¹ בנוסף, בדיקות ספציפיות מחייב mutans סטרפטוקוקוס (MUT590) ^12,13 ו gingivalis Porphyromonas (POGI) ^13,14 שימשו . הקשיות קיצונית של החומרים משטח מעורב (נירוסטה שרף אקרילי) אילצה אותנו למצוא דרכים חדשות להכנת biofilm. כאשר חומרים אלה משטח לא ניתן לחתוך בקלות עם cryotome, שיטות דגימה שונים נחקרו להשיג biofilm אוראלי ללא פגע. עביד ביותר של גישות אלה מוצגת בתקשורת זו. פתיתים קטנים של שרף biofilm נושאי אקריליק היו לגרד עם אזמל סטרילי, נזהרת שלא לפגוע במבנה biofilm. מלקחיים ששימשו לאיסוף biofilm מן משטחי פלדה. לאחר שנאספו, מהדגימות היו קבועים ממוקם ישירות על polysine שקופיות זכוכית מצופה. FISH בוצעה ישירות עם מ 'בדיקות בשקופיות אלהentioned לעיל. פרוטוקולים דגים שונים היו משולבים שונה כדי ליצור פרוטוקול חדש זה היה קל להתמודד. ^5,10,14,15 לאחר מכן הדגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה. ידוע תצורות ^3,4,16,17 יכול להיות דמיינו, כולל פטריות בסגנון תצורות ואשכולות של חיידקים coccoid הספוגה ערוצים. בנוסף, הרכב חיידקי של מבנים אלה biofilm טיפוסי נותחו ותמונות 2D and 3D נוצר.

Protocol

1. הדגימה אוסף הסר קבוע palatal expanders לאחר 4 חודשי עבודות שירות intraoral. השתמש המערכת נולה שדה יבש לבודד את המכשירים לפני הסרתם (איורים 1 ו -2). השתמש צבת מעוקרים, כפפות מגשי להסיר expanders מבלי להוסיף זיהום (איורים 3 ו -4). חנות חפצים Sarstedt 120 מ"ל בקבוקונים ב -20 ° C. קח למעבדה על הקרח תהליך בתוך 24 שעות. 2. Biofilm קיבעון לגרד biofilm פתיתים עם אזמל סטרילי, או לאסוף חתיכות עם מלקחיים סטרילית. הוסף קר כקרח 4% פתרון PFA עד המדגם הוא מכוסה היטב. דגירה את התערובת על 4 ° C (לא להקפיא) למשך 3 עד 12 שעות. פעמים קיבעון ארוכים או קיבעון בטמפרטורות גבוהות עלול להפוך את מעטפות תא של גרם שליליים תאים חדירים פחות בדיקות oligonucleotide. הסר פתרון PFA ולשטוף עם קרים כקרח 1X PBS. חזור על פעולה זו 2-3 פעמים rסר PFA שיורית. Resuspend המדגם כרך 1. קר כקרח 1X PBS ולהוסיף 1 כרך. קר כקרח 96% (v / v) אתנול. אחסן את המדגם ב -20 ° C. דוגמאות קבוע על פי פרוטוקול זה יכול להיות מאוחסן במשך מספר חודשים עד שנים. 3. התייבשות של דוגמאות קבוע החל μl 5-30 של החומר-PFA קבוע מדגם המיקרוסקופ שקופית. יבש ב 46 מעלות צלזיוס כ 15 דקות או בטמפרטורת החדר למשך זמן ארוך יותר. ההפשרה ליזוזים ואת לפוראמיד. הוסף 250 μl של ליזוזים (1mg/ml) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ובכך להקל על חדירה של בדיקות לתוך התאים על ידי נטרולם של קירות התא. טובלים להחליק לתוך 50%, 80% ו 96% (v / v) אתנול עבור 3 דקות כל אחד. ההשפעה dehydrating של הסדרה ריכוז האתנול יהיה לפורר את קרום התא. יבש את השקופיות על 46 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. 4. In-situ הכלאה הכן 1 מ"ל שלהכלאה חיץ טרי (ראה לוח 1 עבור ריכוזים). ריכוזים לפוראמיד השתמשו במחקר זה: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) או 45% (LGCmix). ההפשרה פתרונות בדיקה oligonucleotide. בדיקות מופשר יש לשמור על הקרח ומוגן מפני אור. הוסף 2 μl של בדיקה לכל 200 μl של חיץ הכלאה, ומערבבים היטב וליישם את התערובת המדגם מיובש על שקופיות מיקרוסקופ. מניחים פיסת נייר לתוך צלחת פטרי רבוע ויוצקים את החיץ הכלאה שנותרו על הנייר את הרקמה. מיד למקום את השקופית אופקית לתוך התבשיל ולסגור את המנה. דגירה בתנור על 46 מעלות צלזיוס במשך 1-5 שעות (90 דקות יספיקו ברוב המקרים). הפונקציות צלחת כמו חדר לחות ומניעת אידוי של פתרון הכלאה של השקופית. בפרט, אידוי לפוראמיד יכול לגרום הלא ספציפית מחייב בדיקה ליעד הלא תאים. הכן 50 מ"ל של חיץ כביסה (ראו טבלה 2 עבור concentrations). הכן את החיץ כביסה בתוך שפופרת 50 מ"ל ו – מחממים עד 48 מעלות צלזיוס באמבט מים. צעד כביסה מבוצעת 48 ° C. הסר את צלחת עם שקופית מהתנור הכלאה. מיד לשטוף את המאגר הכלאה עם נפח קטן של חיץ מראש חימם כביסה, ולהעביר את השקופית לתוך המאגר כביסה הנותרים. מניחים את הצינור המכיל את מאגר כביסה השקופית בחזרה לאמבטיה מים לדגור על 48 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. הסר שקופיות הצינור לטבול לתוך קר כקרח DDH 2 O ל 2-3 שניות כדי לחסל חיץ כביסה שיורית. אוויר יבש השקופיות מהר ככל האפשר (את השימוש של אוויר דחוס מומלץ). ייבוש מהיר תפחית בדיקה דיסוציאציה. מגלשות יבשים ניתן לאחסן בחושך ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות ללא איבוד משמעותי של אות בדיקה שמעניקה פלואורסצנטי. 5. מיקרוסקופיה אחרי הדגים כביסה, Apply שתי טיפות antifadent לסגור את הקצוות השמאליים והימניים של שקופית (פרוסות קפוא יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני שלב זה). מקום כיסוי מיקרוסקופ להחליק על גבי ולהמתין עד antifadent התפשט על פני השקופית כולה. שים לב כי כמות מוגזמת של antifadent יכול לטשטש את תמונת מיקרוסקופ. שים את דגימות תחת מיקרוסקופ סורק לייזר confocal מצויד מסננים או לייזרים מתאים. השתמשנו TCS לייקה יחידה (HCX PL APO/63x: NA 1.2). הנתונים ניתן לנתח עם תוכנות כגון IMARIS או עמירה. שקופיות מוטבעים antifadent ניתן לאחסן 4 ° C (לא להקפיא) עד 7 ימים לפני בדיקה, שמעניקה הקרינה מתחילה לרדת. לחלופין, antifadent ניתן להסיר עם DDH 2 O, ואת השקופיות יבשים ניתן לאחסן -20 ° C במשך תקופה ארוכה של זמן. 6. נציג תוצאות: אוספות את biofilm מכשירים אורתודונטים קבועים (איור 5) תשואות פתיתים מתאים (איור 6) כי יכול להיות הכלאה ישירות על שקופיות הזכוכית מצופה עבור במיקרוסקופ. בדרך זו, קבוצות שונות של חיידקים orobiome ניתן לזהות את הסביבה הטבעית תלת ממדי על ידי rRNA תיוג חיידקי עם בדיקות ספציפיות שכותרתו שונה (איורים 7 ו -8). באיור 7, biofilm היה מוכתם EUBmix (ירוק, כל החיידקים) ו LGCmix (צהוב, Firmicutes). Firmicutes מופיעים ירוק, כפי שהם היו מוכתמות צהוב וכחול. באיור 8, biofilm היה מוכתם EUBmix (אדום, כל החיידקים), Bac303 (כחול, Bacteroidetes) ו POGI (צהוב, gingivalis Porphyromonas). Gingivalis Porphyromonas מוצג לבן צהבהב, כמו בכל שלוש בדיקות להיקשר ל-DNA שלו, את החפיפה תוצאות הצבעים אות לבנה. הבדלים מורפולוגיים בין קבוצות של חיידקים יכולים גם להיות מזוהה (איורים 9 ו -10). אשכולות גדולים של חיידקים coccoid מוצגים באיור 9, שם מכתים בוצע EUBmix (ירוק, כל תואר ראשוןcteria). צורות שונות של חיידקים דרך הפה היו דמיינו איור 10, שבו חיידקים coccoid ו פילמנטיות ניתן להבחין על ידי צביעה עם EUBmix (אדום). כמו כן, מבנה אופייני דמוי הפטרייה של biofilm יכול להיות מעובד באמצעות מודלים 3D של הנתונים CLSM (איורים 11 ו -12) לחץ כאן כדי לצפות בסרט של מודלים 3D. באיור 1. קבוע palatal expander באתרם. איור 2. מערכת נולה שדה יבש. באיור 3. צבת הוא עיקר, כפפות מגש. איור 4. הוסר ההרחבה. איור 5. אוספות את biofilm עם אזמל סטרילי. איור 6. פתיתים שרף הכלאה ישירות על שקופיות הזכוכית מצופה. איור 7 תמונה CLSM:. בידול של קבוצת חיידקים ספציפיים. כיסוי 2D ערימת נתונים 3D CLSM. Biofilm מוכתם EUBmix (ירוק, כל החיידקים) ו LGCmix (צהוב, Firmicutes). איור 8 תמונה CLSM:. בידול של קבוצת חיידקים ספציפיים. כיסוי 2D ערימת נתונים 3D CLSM. Biofilm מוכתם EUBmix (אדום, כל החיידקים), Bac303 (כחול, Bacteroidetes) ו POGI (צהוב, gingivalis Porphyromonas). איור 9 תמונה CLSM:. בידול של מורפולוגיות ספציפיים. כיסוי 2D ערימת נתונים 3D CLSM. Biofilm מוכתם EUBmix (ירוק, כל החיידקים). אשכולות גדולים של חיידקים coccoid (חיצים). . איור 10 CLSM תמונות: בידול של מורפולוגיות ספציפיים. כיסוי 2D ערימת נתונים 3D CLSM. Biofilm מוכתם EUBmix (אדום, כל החיידקים). Coccoid (חץ למטה) וחיידקים פילמנטיות (חץ למעלה) ניתן להבחין. איור 11. מבנה פטריות, תצוגות 3D מלמטה. ערימות של biofilm פתיתים (לגרד פני השטח של מכשיר אורתודונטי), מוכתם EUBmix ו processed עם IMARIS (תמונה CLSM). איור 12. מבנה פטריות, להציג צד 3D. ערימות של biofilm פתיתים (לגרד פני השטח של מכשיר אורתודונטי) מעובד עם IMARIS (תמונה CLSM). הכלאה חיץ (200 μl) לפוראמיד ריכוז 10% 20% 45% 5 M NaCl 36 36 36 1 M טריס-HCl 4 4 4 2% SDS 1 1 1 FA 20 40 90 <strong> DDH 2 O 138 118 68 כל בדיקה FISH 2 2 2 טבלה 1. מרכיבי חיץ הכלאה (ריכוזים ב μl). חיץ כביסה (50 מ"ל) לפוראמיד ריכוז 10% 20% 45% 5 M NaCl 4500 2150 300 1 M טריס-HCl 1000 1000 1000 0.5 M EDTA 0 500 500 DDH 2 O 44 500 46 350 </td> 48 200 טבלה 2. מרכיבי חיץ כביסה (ריכוזים ב μl). סרט 1. לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

Discussion

להלן פרוטוקול המתואר היא גישה מעשית מאוד biofilms מכתים שנאספו חומרים קשים. דגימה הכלאה השלבים הקריטיים ביותר. במהלך הדגימה, יש להקפיד כי פרוסות בעובי הולם נאספים כדי להבטיח את מבנה biofilm נשאר שלם. במהלך ההכלאה, זה חיוני כדי למנוע תנודות מוגזמות בטמפרטורה, ובכך נמנע הלא ספציפית מחייב, או אובדן של הכריכה, של בדיקות שכותרתו fluorescently. זה פרוטוקול FISH היא שיטה אלגנטית להכתים biofilm הטרוגנית רגילה ישירות על שקופיות זכוכית מבלי לשבש את הרכבו. השקופיות יכול מיד לשמש מיקרוסקופיה ללא צורך להזיז את המדגם שוב. בדרך זו, שיפור פני מכתים בתוך צינורות מושגת על ידי כוח גזירה פחות מוחל על biofilm. Slices> 50 מיקרומטר עבה יכול להיות מוכן לחקור באופן זה.

Materials

Oligonucleotides	Target organism	Fluorochrome
EUB338 – 338III	Eubacteria	Cy3
LGC354 A-C	Firmicutes	FITC
Bac303	Bacteroidetes	Cy5
Mut590	Streptococcus mutans	FITC
POGI	Porphyromonas gingivalis	FITC

Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).

Component	Company	Comments
4% paraformaldehyde		4% solution in PBS
1 x PBS		3 x solution prepared
ddH2O	Millipore
Ethanol (100%)	Merck
Lysozyme	Roth	100 mg/ml stock solution
Formamide	Roth	99.5% solution
5 M NaCl	Roth
1 M Tris-HCl	Roth
2% SDS	Roth
FISH probes (oligonucleotides)	Invitrogen, Sigma
ProLong Gold antifadent	Invitrogen
Nail polish
Equipment
Incubator	Thermo Scientific
Water bath	IKA Tez
50 ml tubes	Sarstedt
Polysine-coated slides	Thermo Scientific

Table 4. Materials and equipment.