Summary
Biz farklı nörotransmitterlerin iyi kontrollü bir şekilde bir beyin dilim microscale yüzeyleri açığa çıkarmak için standart elektrofizyoloji kurulumları ile entegre edilebilir basit bir mikroakışkan cihaz imalatı göstermektedir.
Abstract
Biz mevcut elektrofizyoloji kurulumları kolaylıkla entegre edilebilir bir iki düzey mikroakışkan cihazın imalat göstermiştir. Iki düzey mikroakışkan bir cihaz, iki adımlı standart litografi süreci 1 karşı negatif kullanılarak imal edilir. Ilk seviye her iki ucunda, giriş ve çıkış delikleri ile mikro içerir. Ikinci düzey, kanal uzunluğu ortasında bulunur ve kanal genişliği ile birlikte merkezli microscale yuvarlak delikler bulunur. Pasif pompalama yöntemi giriş limanından çıkış noktası 2 sıvıları pompalamak için kullanılır. Mikroakışkan cihaz off-the-raf perfüzyon odaları ile entegre ve elektrofizyoloji kurulum ile sorunsuz entegrasyon sağlar. Sıvıları yoluyla giriş çıkış portları doğru mikro port akış tanıtıldı ve aynı zamanda perfüzyon banyo içine mikro üstünde bulunan dairesel açıklıklar yoluyla kaçmak. Böylece perfüzyon odasının banyosuna yerleştirilir ve mikroakışkan cihaz üzerinde beyin dilim alt yüzeyi farklı nörotransmitterlerin maruz kalabilir. Mikroakışkan cihaz ve malzemelerin şeffaf doğası microscale kalınlığı [cam lamel ve PDMS (polidimetilsiloksan)] mikroakışkan cihaz beyin dilim mikroskopi izin yapmak için kullanılır. Mikroakışkan cihaz, beynin dilim mikroçevrelerde tanıtıldı kimyasal uyaranlara modülasyonu (hem mekansal ve zamansal) sağlar.
Protocol
SU-8 kalıp imalatı
Yüksek Lisans hazırlık
- SU-8 ana silikon gofret substrat iki adımlı standart negatif karşı litografi süreci kullanılarak hazırlanmıştır.
- Silikon gofret hizalama işaretleri bu yapıların yüksekliği gibi bir jilet kullanarak kaldırılır (gofret dış çevre boyunca yer) gerçek cihaz yapıları daha fazla.
- Silikon gofret izopropil alkol ile temizlenmeli ve N 2 akışı kurutulur. En yüksek cihaz yapısı daha az bant kalınlığı ile yapılmış Destek ayağı gofret dört taraftan hizalama işaretlerini değiştirin.
Not: destek ayağı yüksekliği en yüksek aygıt yapılardan daha fazla ise, delik PDMS kalıp oluşmuş değildir. - Ana silikon gofret oda sıcaklığında sıcak bir plaka üzerine yerleştirilir.
PDMS çözüm hazırlığı
- Dört gram polidimetilsiloksan (PDMS) çözümü, 1 kısım sertleştirici ile 10 parça silikon elastomer iyice karıştırılarak hazırlanır.
Not: iki çözüm PDMS kalıp boyunca benzer fiziksel özellikler elde etmek için düzgün karışık olduğunu emin olun. - PDMS çözüm karıştırma işlemi sırasında oluşturulan kabarcıklar, bir vakum desikatörde kullanarak kaldırılır.
PDMS kaplama ve kür
- Kabarcık PDMS çözüm yavaş kabarcıkları dağıtım işlemi sırasında oluşturulan olmadığını emin olun SU-8 master üzerine sürülür.
- Bir ucu yazma şeffaflık film sonra sıcak bir plaka üzerine yerleştirilir ve yavaş yavaş PDMS SU-8 master üzerine eşit olarak yaymak için PDMS çözüm yerleştirilir. Bu işlem sırasında oluşan kabarcıkları bir prob kullanılarak kaldırılması gerekir.
[Not: daha fazla baloncuklar nesil önlemek için şeffaflık kaldırmayın.] - Bir borofloat levha üniform basınç uygulamak için saydamlık levha üstüne yerleştirilir. Şeffaflık ve dairesel SU-8 yüzey arasında sıkışmış minimal veya hiç PDMS olduğu gibi en yüksek dairesel yapıların (kanal uzunlukları ortasında bulunur ve kanalların genişliği boyunca merkezli) üst yüzeyi hafif basınç uygulanır yapılar.
- Üç borofloat plaka daha önce üst yüzeyi dairesel açılma yapıları ve kür işlemi sırasında sabit basınç uygulamak için silikon yonga levha sandviç borofloat üstüne yerleştirilir.
- Sonra sıcak plaka sıcaklığı 75 ° C ve PDMS bu sıcaklıkta 1 saat süreyle tedavi. Sıcak plakası 50 ° C'lik bir sıcaklık getirdi.
- Plaka kaldırılır ve şeffaflık hafifçe yüksek lisans ve üst kaplı ince PDMS levha geride bırakarak kaldırılır.
Mikroakışkan cihaz İnşaatı
PDMS sayfalık ana kaldırılması
- Perfüzyon odasının dış sınır SU-8 ana limanları ile perfüzyon odasının limanları hizaladıktan sonra bir jilet kullanarak PDMS kağıda oyulmuş.
- PDMS sayfasına yavaşça PDMS yırtılmasını önlemek için kanalların uzunluğu boyunca çekerek, ana kaldırılır. PDMS levha, yukarı bakacak şekilde mikroakışkan ağ yüzeyi ile bir saydamlık kağıda yerleştirilir.
- Giriş ve çıkış delikleri sonra bir mantar delici kullanılarak yapılır.
PDMS levha cam lamel bağlanması
- PDMS levha (yüzey mikroakışkan ağ içeren) ve cam lamel yapışma yüzeyine yavaşça şeffaflık bir levha üzerine yerleştirilir, 3M seloteyip kullanılarak temizlenmeli ve nihayet O 2 plazma odasına yerleştirilir.
- Yapıştırma yüzeyleri 10 sn için 165 Watt plazma ile tedavi edilir Cam lamel plazma tedavi yüzey PDMS sac plazma tedavi yüzey hemen yapıştırılır.
Not: yapışma yüzeyleri arasında sıkışmış hava kabarcıkları cam yüzey üzerine hafif bir basınç uygulayın. - PDMS ve cam arasında iyi bir bağ elde etmek için 5 dakika izin ver. PDMS levha yapıştırma işlemi için yerleştirilmiş olduğu şeffaflık 5 dakika sonra yavaşça çıkarın.
- Mikroakışkan cihaz kanalları hidrofilik yapmak için oksijen plazma sistemi yerleştirilir. 1 dakika için 165 Watt plazma tedavisi yapılır.
Mikroakışkan cihaz ve perfüzyon odası Entegrasyonu
Perfüzyon odasının hazırlanması
- Bir off-the-raf perfüzyon odası emredildi, giriş ve çıkış delikleri mikroakışkan cihaz ve oda gümrüklü, limanları ve cihaz odasının hizalanır ve böylece delinmiş. Perfüzyon odasının alt yüzeyinde P ile kaplıdırDMS odası ve mikroakışkan cihaz arasında sıkı bir sızdırmazlık elde etmek için.
- Yazma şeffaflık sac oda sıcaklığında sıcak bir plaka üzerine yerleştirilir.
- Bir gram PDMS çözümü, daha önce açıklanan benzer bir süreç içinde hazırlanır. Kabarcık PDMS çözüm daha sonra yavaş yavaş baloncuklar şeffaflık sayfasını kaçınarak nesil üzerine sürülür.
- Perfüzyon odasının sonra PDMS çözüm yerleştirilir.
- Borofloat levha, homojen basınç uygulayın ve PDMS, odanın alt yüzeyinde ince bir tabaka elde etmek için odasının üstüne yerleştirilir.
- Sonra sıcak plaka sıcaklığı 75 ° C ve PDMS bu sıcaklıkta 1 saat süreyle tedavi.
Mikroakışkan cihaz bağlanması ve perfüzyon odası
- Levha çıkartılır ve şeffaflık hafifçe perfüzyon odası ve onun alt yüzeyinde ince PDMS levha kaplamalı geride bırakarak kaldırılır. İstenmeyen PDMS erişim limanlarından PDMS çıkarılması için bir jilet ve sivri uçlu prob kullanılarak kaldırılır.
- PDMS yüzey mikroakışkan cihaz ve odasının PDMS alt yüzeyinde yavaşça 3M bant kullanılarak temizlenebilir şeffaflık bir levha üzerine yerleştirilir ve nihayet oksijen plazma odasına yerleştirilir.
- Yüzeyleri 10 sn için 165 Watt plazma ile tedavi edilir Odasının PDMS kaplı yüzey hemen mikroakışkan cihazın PDMS yüzeye yapıştırılır.
Not: yapışma yüzeyleri arasında sıkışmış hava kabarcıkları cam yüzey üzerine hafif bir basınç uygulayın. - Hemen kullanmadan önce, cihaz kanal hidrofilik yapmak oksijen plazma sistemi yerleştirilir. 1 dakika için 165 Watt plazma tedavisi yapılır.
Mikroakışkan cihaz kullanarak nörokimyasal mikroçevresinin beyin dilimleri merceğin
- (Mikroakışkan cihaz) hidrofilik mikro - (perfüzyon odasına) kombinasyonu standart ACSF (Yapay Beyin omurilik sıvısı) solüsyonu ile doldurulur.
- Giriş limanlarında ACSF çözüm küçük damla koyun ve çözüm kanal içine kötülerin izin. Çıkış limanından bir şırınga kullanarak kalan herhangi bir kabarcıklarını çıkarın. Sıvıların girişinden mikroakışkan cihazın çıkış portlarına pasif pompalama izin çıkış limanında büyük bir düşüş ACSF çözüm koyun.
Not: Bakım pasif pompalama yöntemi kullanarak sıvıların akışını sağlayacak kanalları tüm kabarcıkları alınmalıdır. - Fix (mikroakışkan cihaz) - (perfüzyon odasına) düz platformda açılan ve mikroskop adaptörü içine düz bir platform düzeltmek.
- Standart giriş ve çıkış (emme) standart ACSF solüsyonu ile beyin dilim sürekli perfüzyon için perfüzyon odasının için boru bağlayın. ACSF çözümü sürekli olarak% 95 O2-% 5 CO 2 ile aspire edilir .
Not: ACSF perfüzyon odasının banyosunda sabit bir düzeyde tutmak için emme boru konumunu ayarlayın . - Perfüzyon odasının ACSF çözümü ile doldurduktan sonra, bir damlalık kullanarak perfüzyon odasında bir beyin dilim koyun. Bir prob kullanarak, dairesel açıklıklar mikroakışkan cihaz üzerinde beyin dilim yerleştirin. Beyin dilim dairesel açıklıklar üzerinde istenilen pozisyona sonra beyin dilim hareketsiz bir dilim çapa kullanın.
- Mikroakışkan aygıt şimdi sıvıların pompalanması pasif kullanarak çeşitli nörotransmitterlerin beyin dilimleri (perfüzyon odasında ve mikroakışkan ağ üstüne yerleştirilir) ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut macroscale veya microscale beyin dilim perfüzyon odaları nörotransmitterlerin beyin dilimleri maruz sağlar uzaysal çözünürlük açısından sınırlıdır. Burada gösterilen mikroakışkan cihaz teknolojisi basit bioMEMS teknikleri kullanarak bu sınırlama üstesinden gelir. Bu basitlik mikroakışkan cihazın imalat ve mevcut elektrofizyoloji kurulumları ile entegre kolaylığı göstermiştir cihaz teknolojisi yaygın uygulama izin vereceği tahmin edilmektedir. Daha önce mümkün olmayan ilginç deneyler mevcut mikroakışkan cihazı ile yapılabilir. Farklı zaman ölçeklerinde farklı nörotransmitterlerin beyin dilim Farklı mikroçevrelerde maruz kalabilir. Mevcut prototip cihazı yanyana bulunan sadece dört paralel kanal ve dairesel açıklıklar oluşur. Ancak, bu cihaz düzeni farklı şekil ya da boyutları, ya da mikro açıklıklar, beyin dilimleri farklı mikroçevrelerde açıklıklar konumlandırma yol açacak bir moda salına olabilir olurdu farklı tasarımlar uygulayarak kolayca değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, farklı alanlarda biyoloji göstermiştir mikroakışkan teknoloji içeren işbirlikleri açıktır.
Acknowledgments
Finansman NIH MH-64.611 ve NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü verilmiştir. Yazarlar ayrıca, teknik yardım için, Adam Beagley, Mark Dikopf, ve Ben Smith kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
