Summary
Demonstreren we de fabricage van een eenvoudige microfluïdische apparaat dat kan worden geïntegreerd met standaard elektrofysiologie opstellingen om microschaal oppervlakken van een brein slice bloot in een goed gecontroleerde manier aan verschillende neurotransmitters.
Abstract
We hebben aangetoond dat de fabricage van een twee-niveau microfluïdische apparaat dat gemakkelijk kan worden geïntegreerd met bestaande elektrofysiologie setups. De twee-niveau microfluïdische apparaat is vervaardigd met behulp van een twee-staps standaard negatieve weerstaan lithografie-proces 1. Het eerste niveau bevat microkanalen met in-en uitlaatpoorten aan elk uiteinde. Het tweede niveau bevat microschaal ronde gaten gelegen midden van het kanaal lengte en het midden, samen met kanaalbreedte. Passieve pompen methode wordt gebruikt om vloeistoffen pomp van de inlaatpoort naar de uitlaat poort 2. De microfluïdische toestel is geïntegreerd met off-the-shelf perfusie kamers en maakt een naadloze integratie met de elektrofysiologie setup. De vloeistoffen geïntroduceerd op de inlaatpoorten stroom door de microkanalen naar de uitlaat-poorten en ook ontsnappen door de ronde openingen op de top van de microkanalen in het bad van de perfusie. Dus de onderkant van de hersenen slice geplaatst in de perfusie kamer bad en boven de microfluïdische apparaat kan worden blootgesteld met verschillende neurotransmitters. De microschaal dikte van de microfluïdische apparaat en het transparante karakter van het materiaal [glas dekglaasje en PDMS (polydimethylsiloxaan)] gebruikt om de microfluïdische apparaat laat microscopie van de hersenen slice. De microfluïdische apparaat biedt de mogelijkheid modulatie (zowel in tijd en ruimte) van de chemische prikkels geïntroduceerd om de hersenen slice micro-omgevingen.
Protocol
SU-8 schimmel fabricage
Master voorbereiding
- De SU-8 meester op silicium wafer substraat wordt bereid met behulp van een twee-staps standaard negatieve weerstaan lithografie-proces.
- De uitlijning markeringen op de silicium wafer worden verwijderd met behulp van een scheermesje als de hoogte van deze structuren (gelegen langs de buitenste rand van de wafer) is meer dan de werkelijke device structuren.
- De silicium wafer wordt vervolgens gereinigd met behulp van isopropylalcohol en gedroogd in een stroom van N 2. Steunpilaren uit de tape gemaakt met dikte van minder dan het hoogste apparaat structuur vervangt de uitlijntekens op vier zijden van de wafer.
Opmerking: Als de steunpilaren hoogte meer dan de hoogste apparaat structuren, de door de gaten zijn niet gevormd in het PDMS mal. - De master silicium wafer wordt geplaatst op een hete plaat aan de kamertemperatuur.
PDMS-oplossing voorbereiding
- Vier gram polydimethylsiloxaan (PDMS) oplossing wordt bereid door grondig te mengen 10 delen van silicone elastomeer met 1 deel verharder.
Opmerking: Zorg ervoor dat de twee oplossingen gelijkmatig worden gemengd om soortgelijke fysische eigenschappen te verkrijgen in de PDMS mal. - De belletjes gegenereerd in de PDMS oplossing tijdens het mengproces worden verwijderd met behulp van een vacuümexsiccator.
PDMS-coating en uitharden
- De bel-vrije PDMS oplossing wordt langzaam afgegeven op de SU-8 meester ervoor te zorgen dat bellen niet worden gegenereerd tijdens de verstrekking proces.
- Het ene uiteinde van een waardevermindering op transparante film wordt dan geplaatst op de hete plaat en langzaam op de PDMS oplossing gelijkmatig verspreiden van de PDMS op de SU-8 master. Eventuele luchtbellen die tijdens dit proces moeten worden verwijderd met behulp van een probe.
[Opmerking: Til de transparantie te genereren van meer bubbels te voorkomen.] - Een borofloat plaat wordt geplaatst op de top van de transparantie plaat om uniforme druk uit te oefenen. Zachte druk wordt toegepast op de bovenzijde van de hoogste cirkelvormige structuren (gelegen midden van het kanaal lengtes en gecentreerd over de breedte van de kanalen), zodat er een minimale of geen PDMS ingeklemd tussen de transparantie en de SU-8 oppervlak van de ronde structuren.
- Nog drie borofloat platen worden geplaatst op de top van de silicium wafer-borofloat plaat sandwich om een constante druk uit te oefenen op de bovenkant van de ronde opening structuren voor en tijdens het uithardingsproces.
- De temperatuur van de hete plaat wordt vervolgens verhoogd tot 75 ° C en het PDMS is uitgehard bij deze temperatuur gedurende 1 uur. De hete plaat is op een temperatuur van 50 ° C.
- De platen worden verwijderd en de transparantie wordt voorzichtig verwijderd, met achterlating van de kapitein en de dunne plaat PDMS gecoate op de top van het.
De bouw van de microfluïdische apparaat
Verwijdering van PDMS vel van master
- De buitenste begrenzing van het perfusie kamer is gesneden op het PDMS vel met behulp van een scheermesje na het uitlijnen van de poorten op de perfusie kamer met de poorten op de SU-8 master.
- De PDMS vel wordt dan voorzichtig verwijderd van de meester, trekt langs de lengte van de kanalen om te voorkomen dat scheuren van PDMS. De PDMS vel wordt geplaatst op een transparant vel met de microfluïdische netwerk oppervlak naar boven.
- De in-en uitlaatpoorten worden dan gemaakt met behulp van een kurkboor.
Verlijmen van PDMS vel om glas dekglaasje
- De hechting oppervlak van het PDMS vel (het oppervlak met de microfluïdische netwerk) en een glazen dekglaasje worden vervolgens voorzichtig gereinigd met een 3M plakband, geplaatst op een vel van transparantie, en uiteindelijk geplaatst in de O 2 plasma kamer.
- De te verlijmen oppervlakken zijn behandeld met 165 Watt plasma voor 10 s. De plasma behandelde oppervlak van het glas dekglaasje is direct gebonden aan de plasma behandelde oppervlak van het PDMS vel.
Let op: Breng lichte druk op het glas oppervlak om eventuele luchtbellen gevangen tussen de te verlijmen oppervlakken te verwijderen. - Laat 5 minuten om een goede hechting tussen de PDMS en glas te verkrijgen. Na 5 minuten verwijder voorzichtig de transparantie waarop de PDMS plaat was geplaatst voor de hechting proces.
- De microfluïdische apparaat is geplaatst in de zuurstof plasma systeem om de kanalen hydrofiel. De plasma-behandeling wordt gedaan op 165 Watt gedurende 1 minuut.
Integratie van microfluïdische apparaat en perfusie kamer
Voorbereiding van de perfusie kamer
- Een off-the-shelf perfusie kamer was besteld, en de in-en uitlaatpoorten werden geboord, zodat wanneer de microfluïdische apparaat en de kamer zijn gebonden, de poorten op de kamer en het apparaat zijn uitgelijnd. De onderkant van de perfusie kamer is bedekt met PDMS om een goede afdichting tussen de kamer en de microfluïdische apparaat te verkrijgen.
- Een waardevermindering op transparantie vel wordt geplaatst op een hete plaat aan de kamertemperatuur.
- Een gram PDMS-oplossing wordt bereid in een proces dat vergelijkbaar is met die eerder beschreven. De bel-vrije PDMS oplossing wordt dan langzaam afgegeven op de transparantie vel te vermijden opwekken van luchtbellen.
- De perfusie kamer wordt dan geplaatst op het PDMS oplossing.
- Een borofloat plaat wordt dan geplaatst op de top van de kamer om gelijkmatige druk toe te passen en een dun laagje PDMS te verkrijgen over de onderkant van de kamer.
- De temperatuur van de hete plaat wordt vervolgens verhoogd tot 75 ° C en het PDMS is uitgehard bij deze temperatuur gedurende 1 uur.
Het verlijmen van microfluïdische apparaat en perfusie kamer
- De plaat is verwijderd en de transparantie wordt voorzichtig verwijderd, met achterlating van de perfusie kamer en de dunne PDMS plaat gecoat op de onderkant. Ongewenste PDMS is verwijderd met behulp van een scheermesje en een scherpe punt sonde voor PDMS verwijdering uit toegangspoorten.
- De PDMS oppervlak van de microfluïdische apparaat en de PDMS onderkant van de kamer worden vervolgens voorzichtig gereinigd met een 3M tape, geplaatst op een vel van transparantie, en uiteindelijk geplaatst in de zuurstof plasma kamer.
- De oppervlakken zijn behandeld met 165 Watt plasma voor 10 s. De PDMS gecoate oppervlak van de kamer is direct gebonden aan het PDMS oppervlak van de microfluïdische apparaat.
Let op: Breng lichte druk op het glas oppervlak om eventuele luchtbellen gevangen tussen de te verlijmen oppervlakken te verwijderen. - Onmiddellijk vóór het gebruik, is het apparaat geplaatst in de zuurstof plasma systeem om de kanalen hydrofiel. De plasma-behandeling wordt gedaan op 165 Watt gedurende 1 minuut.
Blootstellen van de hersenen plakjes op neurochemische micro-omgeving met behulp van de microfluïdische apparaat
- De hydrofiele microkanalen van de (microfluïdische apparaat) - (perfusie kamer) combinatie worden gevuld met standaard ACSF (Artificial cerebrospinale vloeistof) oplossing.
- Doseer kleine druppeltjes ACSF oplossing bij de inlaatpoorten en laat de oplossing om het kwade tot in de kanalen. Verwijder eventuele luchtbellen links met behulp van een injectiespuit uit de uitlaatpoort. Verdeel een grote druppel ACSF oplossing bij de uitlaat poort toe te staan passieve pompen van vloeistoffen van inlaat naar uitlaat poorten van de microfluïdische apparaat.
Let op: Er moet worden genomen om alle luchtbellen te verwijderen uit de kanalen te laten stromen van vloeistoffen met behulp van passieve pompen methode mogelijk te maken. - Bevestig de (microfluïdische apparaat) - (perfusie kamer) combo in de vlakte platform en bevestig de vlakte platform in de microscoop adapter.
- Sluit de standaard in-en uitlaat (zuig) slang aan op de perfusie kamer voor continue perfusie van de hersenen slice met standaard ACSF oplossing. De ACSF oplossing wordt continu afgezogen met 95% O2-5% CO 2.
Let op: Pas de positie van de zuig-buis om een constante niveau van ACSF in het bad van de perfusie kamer te houden. - Zodra de perfusie kamer is gevuld met ACSF oplossing, plaats een brein plak in de perfusie kamer met behulp van een druppelteller. Met behulp van een sonde, de positie van de hersenen slice boven de ronde openingen in de microfluïdische apparaat. Zodra de hersenen slice is op de gewenste positie op de ronde openingen, gebruik dan een slice anker naar de hersenen slice immobiliseren.
- De microfluïdische apparaat kan nu worden gebruikt om de hersenen plakjes (geplaatst in de perfusie kamer en op de top van de microfluïdische netwerk) bloot te stellen aan verschillende neurotransmitters met behulp van passieve verpompen van vloeistoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestaande macroschaal of microschaal de hersenen slice perfusie kamers zijn beperkt in termen van de ruimtelijke resolutie die zij verlenen aan de hersenen plakjes bloot met de neurotransmitters. De microfluïdische apparaat technologie die hier gedemonstreerd overwint deze beperking met behulp van eenvoudige bioMEMS technieken. Wordt verwacht dat de eenvoud in de fabricage van de microfluïdische apparaat en het gemak bij het integreren met bestaande elektrofysiologie setups zal wijdverbreide toepassing van de aangetoonde apparaat technologie mogelijk te maken. Interessante experimenten die niet mogelijk waren eerder kan worden uitgevoerd met de huidige microfluïdische apparaat. Verschillende micro-omgevingen van de hersenen slice kan worden blootgesteld aan verschillende neurotransmitters op verschillende tijdschalen. Het huidige prototype toestel bestaat uit slechts vier parallelle kanalen en ronde openingen naast elkaar gelegen. Toch kan dit apparaat lay-out eenvoudig worden gewijzigd door de invoering van verschillende ontwerpen die zou hebben openingen van verschillende vormen of maten, of de microkanalen kan worden kronkelde op een manier die zou leiden tot de positionering van de openingen in de verschillende micro-omgevingen van de hersenen plakjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs staan open voor samenwerkingen met betrekking tot de bewezen microfluïdische technologie om verschillende gebieden van de biologie.
Acknowledgments
De financiering werd verstrekt door NIH MH-64611 en NARSAD Young Investigator Award. De auteurs wil ook Adam Beagley, Mark Dikopf, en Ben Smith erkennen voor hun technische bijstand.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
