Summary
在这个视频中,我们展示了E18皮质大鼠神经元的准备。
Abstract
在这个视频中,我们展示了E18皮质大鼠神经元的准备。 E18皮质大鼠以前解剖,并准备从E18胎鼠大脑皮层神经元得到。 E18皮层,清扫后,立即到单个神经元的分离。它可以存储长达一个星期的E18皮质休眠发送含有B27的缓冲区4 ° C的分解是执行之前。然而,将细胞活力下降。通常情况下,我们获得我们的E18的Cortex新鲜。在冰冷的无钙镁免费清扫缓冲区(招商基金)被运送到实验室。抵达后,胰蛋白酶添加到皮质的终浓度为0.125%。皮层,然后在37℃孵育8分钟。 DMEM培养液含10%胎牛血清添加到皮质停止反应。然后在2分钟2500转离心皮质。上清被删除,含2%B27(体积/体积)和0.25%Glutamax(体积/体积),然后向上和向下吹打重悬的皮质神经基底媒体2毫升(NBM)。下一步,皮质是磨碎与以前火抛光的玻璃滴管,用较小的一个连续的开放每个。研制过程后,皮层再次离心2分钟2500转。然后取出上清液和皮质颗粒重新悬浮2毫升含有B27与Glutamax的NBM。细胞悬液,然后通过一个40微米的尼龙细胞过滤网。下一步的细胞计数。现正准备装载到神经元的微流体装置的神经元。
Protocol
准备E18胎鼠皮层神经元为条块
开始之前,重要的是温暖的一切必要的媒体和试剂,以37 ° C
同样重要的是消毒一切准备的细胞(例如,橡胶灯泡,试管架,媒体瓶,等),并用70%乙醇擦拭,这是摆在引擎盖。
- 放置在一个15毫升中含1毫升冰冷无钙镁免费清扫缓冲管两件E18胎鼠皮层(大脑,以前解剖)。
- 加入1毫升0.25%胰蛋白酶- EDTA的皮质夹层缓冲,使最终体积为2毫升和最终胰蛋白酶的浓度为0.125%。
- 在37℃水浴8分钟中放置15毫升管。
- 在此期间,消防波兰3玻璃巴斯德吸管,形成连续较小的开口,在生物安全柜,以帮助保持无菌。
- 皮层潜伏期8分钟后,添加10毫升的DMEM含10%胎牛血清的皮质,以帮助阻止胰蛋白酶反应。
- 离心15 mL的试管中,在2分钟2500转的皮质和DMEM/10%FBS。
- 在生物安全柜,取出上清液用巴斯德玻璃吸管连接真空吸皮质。要小心不要去打扰或撞出颗粒。
- 加入1毫升的NMB皮层颗粒,轻轻吸管向上和向下。这是非常重要,以避免产生气泡而pipeting向上和向下,气泡可损害细胞氧化。
- 使用最广泛的开放的火抛光的巴斯德吸管磨碎附加无菌的橡胶球,最终pipeting向上和向下的5倍皮层,再小心不要引入气泡。这个过程中继续与其他2个玻璃吸管,每一个开口尺寸减少。
- trituration后,再次离心下来的细胞在2分钟2500转。
- 离心后,再次去除上清,重悬细胞沉淀在2毫升的NBM。
- 通过一个45微米的细胞过滤器过滤悬浮细胞溶液。
- 用台盼蓝染色,计数,并加载到设备的细胞。我们通常装载20细胞每台设备的UL。
注 :终浓度的细胞通常是250万细胞/毫升和800万细胞/毫升之间
载入细胞
后的细胞已被计算,它是时间的负载设备的细胞:
- 把先前准备好的设备,将含有生物安全柜的NBM保持无菌。
- 从井中取出多余的介质,通过真空抽吸。但是,要小心,以避免删除所有的媒体 - 必须有一些媒体的主渠道。
- 20细胞UL应用设备的顶部左手水库(如有必要,见图表)。细胞进入设备的流量和连接到PLL的表面处理。
- 加载后,放置10分钟含细胞回的设备,让细胞附着在一个孵化器。
- 10分钟后,填补与媒体和地方的设备在孵化器的水库。
Discussion
根据不同的应用,可以是多种多样的细胞密度。然而,播种密度过低的主要神经元通常会导致细胞死亡。根据不同的孵化器和湿度水平,媒体可能需要在设备改为每2至3天。不断变化的媒体时,这是很重要的媒体取出后水库,切勿从媒体的主渠道。此外,新媒体,并放置在顶部的井,让一些新鲜的媒体流通过设备进入主渠道,填补了所有的水塘前,它是很好的做法。
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
15 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
37˚C water bath | ||||
Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
DMEM | medium | Invitrogen | ||
FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
centrifuge | set at 2500 rpm | |||
Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).