Un metodo è descritto per la preparazione di un 3-dimensionale matrice costituita da collagene di tipo I e di fibroblasti umani primari. Questo gel organotipica serve come substrato utile per valutare la migrazione delle cellule invasive perché imita caratteristiche di base di stroma tissutale ed è suscettibile di molte forme di microscopia.
Migrazione cellulare è fondamentale per molti aspetti della biologia, compreso lo sviluppo, la guarigione delle ferite, le risposte cellulari del sistema immunitario, e metastasi delle cellule tumorali. La migrazione è stata studiata su vetrini in modo da rendere dinamiche cellulari suscettibili di indagine al microscopio ottico. Tuttavia, è diventato chiaro che molti aspetti della migrazione cellulare dipendono caratteristiche dell'ambiente locale compresa la sua elasticità, composizione proteica, e la dimensione dei pori, che non sono fedelmente rappresentati da due substrati rigidi dimensionali quali vetro e plastica 1. Inoltre, l'interazione con altri tipi di cellule, inclusi i fibroblasti stromali e cellule immunitarie 2, 3 ha dimostrato di giocare un ruolo critico nel promuovere l'invasione delle cellule tumorali. Indagine a livello molecolare ha sempre dimostrato che dinamica molecolare, compresa la risposta al trattamento farmacologico, di cellule identiche sono significativamente differenti rispetto <em> In vitro e in vivo 4.
Idealmente, sarebbe meglio studiare la migrazione cellulare nel suo contesto naturale in organismi viventi, tuttavia questo non è sempre possibile. Intermedi sistemi di coltura di tessuti, come matrice cellulare derivata, Matrigel, coltura organotipica (descritto qui) espianti tissutali, organoidi, xenotrapianti, e sono quindi importanti intermedi sperimentali. Questi aspetti approssimativi sistemi certi di un ambiente in vivo, ma sono più suscettibili di manipolazione sperimentale come l'uso di linee cellulari stabilmente trasfettate, regimi di trattamento farmacologico, a lungo termine e ad alta risoluzione delle immagini. Tali sistemi intermedi sono particolarmente utili come terreni di prova per convalidare le sonde e stabilire i parametri necessari per l'immagine della risposta dinamica di cellule fluorescenti e giornalisti, prima di effettuare l'imaging in vivo 5. Come tali, essi possono svolgere un ruolo importante nel ridurre la necessità di esperimenti su living animali.
Presentiamo qui un metodo per la produzione di una matrice 3-dimensionale adatto per studi di migrazione cellulare invasiva 6-8. La matrice è costituita da collagene di tipo 1 fibrille in subappalto per un periodo di diversi giorni da fibroblasti umani primari epidermiche. Il collagene è preparato mediante estrazione acida non, digestione enzimatica, che conserva reattività alle poli-peptide estremità e promuove reticolazione delle fibrille di collagene in grandi aggregati upon neutralizzazione di condizioni del tampone 9. Ciò comporta una ricostituito gel che più strettamente simula le funzioni di collagene in vivo e ha conseguenze importanti per le proprietà invasive delle cellule coltivate in gel. Non importa se fresco o congelato materiale di partenza viene utilizzato, ma l'uso di code di ratto adolescenti è importante perché il collagene cross-linking è più labile in animali più giovani. Collagene I da animali più giovani è quindi più facile da estrarre, e ri-costituisce with alta fedeltà.
La matrice di collagene può essere fissate e colorate con anticorpi diretti contro sia cellule tumorali invasive o fibroblasti stromali 2,10 e sono molto utili per testare l'efficacia dei farmaci che possono inibire l'invasione 5,6.
Sebbene questo protocollo suggerisce l'uso di fibroblasti umani primari, è possibile utilizzare fibroblasti primari da altri tipi di tessuto, a seconda del tipo di tessuto in esame. È anche possibile stabilire culture utilizzando fibroblasti immortalizzate, comprese le cellule che sono state stabilmente trasfettate con coniugati proteina fluorescente. In questo modo le cellule stromali e sia tumore può essere etichettato per visualizzare interazioni cellulari durante invasione 11.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
10x MEM | Gibco | 21430 | – |
NaOH | Sigma | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
FCS | PAA Laboratories | A15-101 | – |
35 mm dishes | Falcon | 353001 | For step 3.4 |
60 mm dishes | Falcon | 353004 | For step 5.2 |
Spring forceps blunt | Samco | E003/02 | Toothed, not smooth |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 – 14 kD |
PBS | Oxoid | BR0014G | – |
Acetic Acid | Sigma | 242853 | – |
24 well dish | Falcon | 353047 | For step 4.1 |
Fungizone | In vitrogen | 15290018 | – |