Summary
Здесь мы описываем подробные изображения живой клетки методы исследования хемотаксиса. Мы представляем флуоресценции микроскопических методов контроля пространственно-временной динамике сигнальных событий в мигрирующих клетках. Измерение сигнальных событий позволяет нам понять, как дальше GPCR-сети сигнализации достигает градиент зондирования хемоаттрактантов и контролирует направленного миграции эукариотических клеток.
Abstract
Многие эукариотических клетках может обнаружить градиенты химических сигналов в своей среде и мигрировать соответственно 1. Это руководствоваться миграции клеток называется как хемотаксис, что очень важно для различных клеток для выполнения своих функций, таких как торговля иммунных клеток и структурирование нервных клеток 2, 3. Большое семейство G-белком рецепторы (GPCR) обнаруживает переменную небольшие пептиды, известные как хемокины, направить миграции клеток в естественных условиях 4. Конечной целью исследования хемотаксиса чтобы понять, как машины GPCR чувств хемокинов градиенты и контроля сигнализации событий, приведших к хемотаксис. С этой целью мы используем методы визуализации для мониторинга в режиме реального времени, пространственно-временной концентрации хемоаттрактантов, сотовые движения в градиенте хемоаттрактант, GPCR опосредованной активации гетеротримерные G-белком, и внутриклеточных сигнальных событий, участвующих в хемотаксис клеток эукариот 5-8 . Простой эукариотических организмов, Dictyostelium discoideum, отображает chemotaxic поведения, которые аналогичны тем, лейкоцитов и D. discoideum является ключевым модельной системой для изучения эукариотических хемотаксис. Как свободно живущих амеб, Д. discoideum клетки делятся в богатой среде. После голода, клетки вступают программа развития, в котором они совокупный через цАМФ-опосредованной хемотаксис сформировать multicullular структур. Многие компоненты, участвующие в хемотаксис в лагерь были определены в D. discoideum. Связывание цАМФ с GPCR (car1) индуцирует диссоциации гетеротримерные G-белков в Gγ и Gβγ подразделения 7, 9, 10. Gβγ подразделения активировать Ras, который, в свою очередь, активирует PI3K, превращая PIP PIP 2 в 3 на клеточной мембране 11-13. PIP 3 служат сайты связывания белков с pleckstrin Гомология (PH) доменов, таким образом, набор этих белков с мембраной, 14, 15. Активация рецепторов car1 также контролирует мембраны объединений PTEN, который dephosphorylates PIP PIP 3 до 2 16, 17. Молекулярные механизмы эволюционно консервативных в хемокинов GPCR-опосредованной хемотаксис клеток человека, такие как нейтрофилы 18. Мы представляем следующие методы исследования хемотаксиса D. discoideum клеток. 1. Подготовка хемотаксиса клетки компонента. 2. Изображений хемотаксис клеток в цАМФ градиента. 3. Мониторинг GPCR индуцированной активации гетеротримерные G-белка в одном живых клеток. 4. Изображений хемоаттрактант запускаемой динамических PIP 3 ответов в одном живых клеток в реальном времени. Наши разработанные методы визуализации могут быть применены для изучения хемотаксиса лейкоцитов человека.
Protocol
1. Подготовка хемотаксиса компетентные клетки discoideum Dictyostelium
- Для создания Д. discoideum клетки, которые хемотаксиса к хемоаттрактант цАМФ, урожай клеток, растущих в D3-T мультимедийных от тряски культуры при 22 ° C.
- Вымойте клетки дважды в непитательных развития буфера (DB буфера, содержащего 5 мМ Na 2 HPO 4, 5 мМ KH 2 PO 4, 2 мМ MgCl 2 и 0,1 мМ CaCl 2).
- Повторное приостановить клеток в DB буфера при плотности 2х10 7 клеток / мл.
- Встряхните 10 мл клеток в 250 мл колбу на 100 оборотов в минуту при 22 ° С в течение одного часа.
- Доставить по 100 мкл 7,5 фондовом цАМФ мкМ до 10 мл клетки каждые шесть минут в течение 6 часов, чтобы достичь конечной концентрации 75 нМ цАМФ, процесс обозначается как цАМФ пульсирующий лечения. Через 5-6 часа цАМФ пульсирующий лечения, Д. discoideum клетки становятся хемотаксиса компетентных к цАМФ градиента.
- Сбор клетки центрифугированием при 200 г в течение 5 мин, а затем ресуспендирования клеток с буфера БД, содержащей 2,5 мМ кофеином, и встряхнуть при 200 оборотов в минуту при 22 ° С в течение 20 мин до basolate ячейки хемотаксиса ситуации.
2. Изображений chemotaxing клеток в видимом и манипулировать хемоаттрактант градиент
- Засыпка микропипетки со свежеприготовленным 30 мкл раствора 1 мкМ цАМФ и Alexa 594 в 0.1μg/μl в буфер DB.
- Прикрепите к Femtotip микропипетки держателя и подключить трубку к аппарата давление подачи, Эппендорф FemtoJet системы.
- Прикрепить микропипетки сборки микроманипулятора (Eppendorf TransferMan NK2) моторизованные микроманипулятора обеспечить постоянное давление с целью установления стабильного градиента.
- Гора одна и LabTek камере, наполненной 6 мл буфера БД более 40х объектив нефти на конфокальной микроскопии и использовать яркие оптики, центр Femtotip в поле зрения.
- Включите давление питания и установить компенсации давления (PC) на 70 гПа установить градиент цАМФ / Alexa 594 смеси.
- Визуализируйте цАМФ градиент, мониторинг смесь требуемой концентрации цАМФ и Alexa 594 флуоресценции с помощью возбуждения с лазерной линии 543 нм.
- Использование автоматического позиционирования функции микроманипулятора поставить микропипетки в желаемых местах и установить их как положение 1, положение 2, и позиция 3 манипулировать градиент к какой ячейке подвергаются.
3. Неподвижный неполяризованного системы клетки облегчает изображений сигнальных событий, участвующих в цАМФ градиент зондирования
- После кофеином, удалить аликвоту клеток и центрифуге при 500g в течение 3 мин.
- Удалить буфер и разбавленных клетки до 5х10 5 клеток / мл свежего буфера БД, содержащей 2,5 мМ кофеина.
- Нанести 1 мл клеточной суспензии для одного хорошо камере или 0,4 мл в каждую лунку четыре хорошо камере.
- Разрешить клетки придерживаться в течение 10 мин, тщательно пипетки с буфером для удаления одинокие клетки и заменить с тем же объемом.
- Найдите нужный клетки под микроскопом и начать съемки.
- Для эксперимента, предназначенная для контроля динамики сигнализации компонентов в клетках подвергая на устойчивый градиент, лечения клеток с 5,0 мкм (конечная концентрация) Latrunculin В течение 10 мин до начала экспериментов.
4. Одновременный мониторинг гетеротримерные G активация белка и PIP 3 производства
- цАМФ пульсирующие клетки разработки совместного выражения и GαCFP YFPGβ (G клеток) и клеток, экспрессирующих PIP 3 показатель PH-GFP (PH клетки) 7.
- Смешайте эти два типа клеток с соотношении 1:1 и пластины их в одной скважины или 4-х и камер.
- Создание и сохранение выбросов отпечатков пальцев ссылкой кривой CFP, YFP и GFP с помощью лямбда-стека Приобретение режиме в спектральном диапазоне от 464 до 624 нм с шириной 10 нм.
- Одновременно образ G белка активации в клетках G и PIP 3 производства в PH клетки, используя при том же режиме стека Приобретение Lambda в спектральном диапазоне от 464 до 544 нм с шагом 10 нм.
- Применить Линейная функция Unmixing программного обеспечения Zeiss 510META использованием сохранены CFPand YFP и излучение отпечатки пальцев для математически вычислить вклад каждого флуорофора в стек Lambda отделить CFP и YFP интенсивности в отдельных каналов в группе G.
- С той же стратегии, применяются линейные функции Unmixing использованием GFP сохранены отпечатки пальцев и фонового излучения математически вычислить интенсивность в GFP PH клеток.
5. Представитель результаты:
- Отличная система модели Д. discoideum для GPCR опосредованной хемотаксис. социальные амебы, Д. discoideum экспонатов поразительно хемотаксис в течение жизненного цикла. Из-за своей генетической и биохимической преимущества, Д. г обеспечивает мощный ыystem для изучения хемотаксиса.
- Хемотаксис клеток под видимым и манипулировать chemoattract полей. Здесь мы впервые показать простую методологию для получения линейной зависимости между концентрацией цАМФ и интенсивность флуоресцентного красителя Alexa 594 от разбавления серии 2 мкМ цАМФ смешивали с 10 мкг / мл Alexa 594 (рис. 2). Далее, мы предлагаем простой способ визуализировать градиент, кроме того, установить количественные измерения концентрации цАМФ из градиент, интенсивность Alexa 594 (рис. рис. 2B).
- Сотовые подвижность несвязанных с поляризацией клеток и направленного зондирования. Ингибитор полимеризации актина устраняет уже существующие морфологические полярности, а также предотвращает движения клетки при сохранении клеток возможность направленного зондирования (рис. 3А). Занятость видимых и манипулировать цАМФ стимуляции гарантии ввода, например единообразно применяться стимуляции или градиент. Этот метод позволяет количественного анализа цАМФ-индуцированной перераспределение ключевых компонентов сигнализации в градиенте зондирования техники. Измеренные пространственно-временной динамике этих сигнальных компоненты позволяют нам понять, как сети сигнализации достигается адаптация к единому стимуляции при создании поляризованных биохимических ответы на градиентов (рис. 3б).
- Системная измерения кинетики chemosensing сети сигнализации при воздействии устойчивый градиент. Чрезвычайно важно для измерения динамики / Кинетика направленного зондирования сигнализации компоненты, чтобы понять, как каждый компонент вносит свой вклад в создание внутриклеточной поляризации, когда клетки опыт первого градиента. Применение живого изображения клетки с высоким темпом пространственное разрешение, покажем сначала, двухфазный PIP3 производства ячейки, которая подвергается постоянным градиентом цАМФ (рис. 4A-C). Применение жить изображений клетки, мы систематически измерять динамику направленности зондирования конкретных сети сигнализации из лагеря стимуляции PIP3 производства (рис. 4, Е).
- Одновременный мониторинг гетеротримерные белка G активации и PIP 3 производства по ровным слоем цАМФ стимуляцией. Ферстер резонанс передачи энергии (сокращенно FRET) обеспечивает эффективный подход к мониторингу гетеротримерные белка G активации (диссоциации) на цАМФ стимуляции. Здесь мы описали удобный простой внедрять систему для одновременного измерения гетеротримерные белка G активации и PIP 3 производства путем мониторинга FRET изменения и мембраны транслокации PIP 3 зонд, PH-GFP в С и рН клеток соответственно (рис. 5 ). Единообразно применяться цАМФ стимуляция вызывает стойкие белка G в то время как активация которых вызывает переходные PIP 3 производства.
Рисунок 1: отличная система модели Д. discoideum для хемотаксиса GPCR опосредованной. А. Схема показывает краткую сигнального пути направленного зондирования. Б. цАМФ градиент вызывает быстрое хемотаксис D. discoideum клеток. Клетки выразить PIP 3 зонд, PH-GFP (зеленый). Градиент (красный) визуализируется Alexa 594. Шкала бар = 50 мкм.
Рисунок 2: хемотаксис клеток под видимым и манипулировать chemoattract полей. А. На графике показана линейная зависимость между концентрацией цАМФ и интенсивность флуоресцентного красителя Alexa 594 от разбавления серии 2 мкМ цАМФ смешивали с 10 мкг / мл Alexa 594. Б. Количественное измерение концентрации цАМФ градиент линейной зависимости концентрации цАМФ и интенсивности флуоресцентного красителя Alexa 594 в A.
Рисунок 3: Сотовый подвижность несвязанных с поляризацией клеток и направленного зондирования. А. На рисунке показано, что неподвижный клеток лечения ингибитора полимеризации актина Latrunculin B поддержания способности направленного зондирования. Клетки выразить PIP 3 зонд, PH-GFP (зеленый). Градиент (красный) визуализируется Alexa 594. Б. манипулировать цАМФ стимуляции и неподвижные клеточной системы позволяет для решения ключевых вопросов, направленных зондирования. Шкала бар = 10 мкм.
Рисунок 4: Системная измерения кинетики chemosensing сети сигнализации при воздействии устойчивый градиент. А. Монтаж показывает двухфазный PIP 3 производства (Green) из клетки, которая подвергается постоянным градиентом цАМФ (красный). B. На рисунке показано регионах интересов (трансформирования) для измерения кинетики PIP 3 продукция, представленная в С. С . Кинетика ое PIP 3 производства в клетки подвергаются постоянным градиентом. Д. Схема показывает, сети сигнализации направленного зондирования из лагеря стимуляции PIP 3 производства. Их кинетика при воздействии устойчивый градиент представлена в том же цвете сплошные линии на E.
Рисунок 5: Одновременный мониторинг нескольких событий GPCR сигнализации сетей. А. Схема показывает одновременное измерение гетеротримерные белка G активации и PIP 3 производства путем мониторинга FRET изменения и мембраны транслокации PIP3 зонд, PH-GFP в С и рН клетки, соответственно. Б. Монтаж изображения радуги G и PH клетки показывает, , что ровным слоем цАМФ стимуляция вызывает стойкие белка активации G на клеточном периферические, в то время, который вызывает переходные PIP3 производства. Время до точки (0s) и после стимуляции 4.9s, и 10.2s 20.4s. С. Кинетика G активация белка и PIP3 производства по ровным слоем цАМФ стимуляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процессы идущие хемотаксиса компетентных этапе клетки
Для дикого типа D. discoideum клетки, она занимает около 5 ~ 6 часов пульсирующий развития при комнатной температуре, чтобы побудить их в хорошо хемотаксиса компетентных стадию, при которой клетки дисплей хорошо поляризованного клеточной морфологии и быстрой миграции клеток (рис. 1). Некоторые факторы, такие, как концлагерь для пульсирующей, температуры и различных генетических особенностей, может повлиять на процесс достижения хемотаксиса компетентных стадии. Руководств цАМФ градиент клетки двигаться к источнику цАМФ, направленной миграции клеток обозначается как хемотаксис. Однако клетки, которые не достигли хемотаксиса компетентных этапе из-за недостаточного развития или их генетический фон не может показать два характерных особенностей: поляризованных морфологии и быстрое движение клетки. С другой стороны, клетки, которые прошли хемотаксиса компетентных этапе из-за чрезмерного развития часто образуют скопления клеток, которые очень трудно разделить на отдельные клетки для работы с изображениями экспериментов ..
1. Изображений chemotaxing клеток в видимом и манипулировать хемоаттрактант градиент
Это технический прогресс применять флуоресцентно меченных и манипулировать хемоаттрактант стимуляции в экспериментальной системе. Исторически сложилось, что мы подали либо однородно применять стимуляцию (также называется равномерной стимуляции) или градиент стимуляции для наблюдения морфологии клеток и поведения. Тем не менее, "слепые" стимуляция не показывает темп-пространственной информации о том, как стимулы достигает клеток, поэтому ставит под сомнение любую "ненормальной" наблюдения клеточного ответа. Здесь мы покажем применение флуоресцентного красителя (Alexa594, молекулярная Probe) с хемоаттрактант установить линейную зависимость между концентрацией хемоаттрактант и интенсивность контроля флуоресцентных день и (рис. 2а, б). Приобретение сочетание зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного излучения флуоресцентных красителей (Alexa594), которая позволяет контролировать как стимулирование и клеточного ответа на этот стимуляции (рис. 2).
Согласно экспериментальным требования, Есть более комбинаций. При рассмотрении новых флуоресцентных красителей, очень важно, чтобы подтвердить флуоресцентные подходит для вашего эксперимента, особенно для градиента эксперимент, важно, чтобы подтвердить диффузии совместно эффективность Вашего раздражения и флуоресцентным красителем. Кроме того, для получения линейной зависимости стимулов концентрации и интенсивности смешанного флуоресцентного красителя, необходимо получить максимальную концентрацию раздражителей без насыщения интенсивности.
2. Неподвижный неполяризованного системы клетки облегчает жить визуализации ячейки
Хемотаксис является сложным клеточный процесс, однако он может быть разбит на три основных аспекта: сотовые поляризации, подвижности и направленного зондирования. Морфологически поляризацию называют четко определены ведущие передние и задний конец клетки. Многие сигнализации компонентов, вовлеченных в хемотаксис локализоваться в любом fornt или еще в поляризованных клетках. Направленная зондирование возможности клетка перевести внеклеточной градиент в поляризованном внутриклеточных биохимических поляризации. Как показано на рис. 3А, обработка клеток с актином ингибитор полимеризации (Latrunculin B) быстро устраняет подвижность клетки и ее первичная поляризация. Поразительно, что клетки все еще в состоянии установить внутриклеточной поляризации, такие как накопление PIP 3 в передней части клетки, стоящие перед градиентом (как показано на полумесяц PIP3biosensor, PH-GFP), что свидетельствует о направленности зондирования клетки могут быть отцепили от поляризации клеток и их подвижность. Это неполяризованных клеточной системы позволяет определить кинетику сигнализации компоненты, которые необходимы для chemosensing без осложнений подвижности клеток и предыдущие поляризации. За и против, лечение ингибитором полимеризации актина уничтожает все, что динамика иждивенцев на актин-цитоскелета.
3. Мониторинг сети сигнализации на нескольких спектральных изображений жить клетка
Участие цАМФ со своим рецептором вызывает активацию гетеротримерные белка G. Как впоследствии Gβγ субъединица диссоциирует от Gα субъединицы и активизирует вниз по течению, чтобы побудить эффекторов клеточного ответа, такие как PIP3 производства. Технический прогресс на темпо-пространственным разрешением флуоресцентной микроскопии позволяет одновременные снимки несколько сигнальных событий на субклеточном уровне в живых клетках. В этом разделе мы сначала показать одновременные снимки двух сигнальных молекул, наряду с мониторингом цАМФ градиент (рис. 4а). Затем, мы спектральных изображений G активации и ее вниз по течению клеточного ответа из PIP3 производства (рис. 4б). Ферстеррезонанс передачи энергии (сокращенно FRET), также известный как флуоресценции передачи энергии резонанс, резонанс передачи энергии (RET) или электронного перевода энергии (EET), представляет собой механизм, описывающий передачу энергии между двумя хромофоров. Существуют три критерия для возникновения FRET: перекрытия излучения донора и акцептора возбуждения, соответствующие ориентации, и небольшое расстояние (<10 нм). Расстояние / ориентации требование двух молекул облегчает FRET быть эффективным средством для обнаружения белок-белковые взаимодействия или изменения intromolecular конформации белка. Здесь мы использовали общие использовать CFP / YFP FRET пары (Gα-CFP/Gβ-YFP) для мониторинга динамической диссоциации г белка α / βγ подразделений в живых клетках. Как умный опытно-конструкторских мы описали здесь является сочетание двух различных типов клеток, с тем чтобы одновременно контролировать обе активации G белка и PIP3 производства, когда оно не удобно измерять все динамики в одной ячейке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке очной фонд из NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| cAMP | Sigma-Aldrich | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc international | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus Corporation | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N.
