Récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum</em

Résumé

Ici, nous décrivons les méthodes détaillées direct imagerie cellulaire pour enquêter sur le chimiotactisme. Nous présentons la fluorescence des méthodes microscopiques pour surveiller la dynamique spatio-temporelle des événements de signalisation dans les cellules en migration. Mesure des événements de signalisation nous permet de mieux comprendre comment un réseau de signalisation GPCR réalise gradient de détection et de contrôle des chimiotactiques migration directionnelle des cellules eucaryotes.

Résumé

Beaucoup de cellules eucaryotes peuvent détecter des gradients de signaux chimiques dans leur environnement et de migrer en conséquence ^1. Cette migration cellulaire guidée est mentionné que le chimiotactisme, qui est essentiel pour différentes cellules pour mener à bien leurs fonctions telles que le trafic des cellules immunitaires et la structuration des cellules neuronales ^{2, 3.} Une grande famille de G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) détecte la variable de petits peptides, connu sous le nom de chimiokines, de diriger la migration cellulaire in vivo ^4. L'objectif final de chimiotactisme de recherche est de comprendre comment un gradient de chimiokine GPCR machines et des commandes de signalisation sens des événements menant à la chimiotaxie. À cette fin, nous utilisons des techniques d'imagerie pour suivre, en temps réel, les concentrations spatio-temporelle des mouvements chimiotactiques cellulaire, dans un gradient de chimiotactique, GPCR activation médiée par des protéines G hétérotrimériques, et les signaux intracellulaires impliqués dans le chimiotactisme des cellules eucaryotes ^5-8 . L'organisme simple eucaryotes, Dictyostelium discoideum, affiche des comportements chemotaxic qui sont similaires à celles des leucocytes, et D. discoideum est un système modèle pour l'étude des principaux chimiotactisme eucaryotes. Comme amibes libres, D. discoideum cellules se divisent en milieu riche. Après la famine, les cellules entrer dans un programme de développement global dans lequel elles par le biais de l'AMPc à médiation chimiotactisme pour former des structures multicullular. De nombreux composants impliqués dans le chimiotactisme au camp ont été identifiés dans D. discoideum. La liaison de l'AMPc à un GPCR (CAR1) induit la dissociation des protéines G hétérotrimériques dans Gγ et ⁷ sous-unités ^{Gßy, 9, 10.} Sous-unités Gßy activer Ras, qui active à son tour la PI3K, la conversion PIP PIP ₂ en ₃ sur la membrane cellulaire ^{de 11 à 13.} PIP ₃ servent de sites de liaison pour des protéines ayant une homologie avec pleckstrine (PH) domaines, recrutant ainsi ces protéines à la membrane ^{14, 15.} L'activation des récepteurs CAR1 contrôle également les associations de la membrane de PTEN, qui déphosphoryle PIP PIP ₃ à ₂ ^{16, 17.} Les mécanismes moléculaires sont évolutivement conservées dans des chimiokines GPCR médiée par le chimiotactisme des cellules humaines telles que les neutrophiles ^18. Nous présentons des méthodes suivantes pour étudier le chimiotactisme des D. cellules discoideum. 1. Préparation des cellules composant chimiotactiques. 2. Imagerie chimiotactisme des cellules dans un gradient d'AMPc. 3. Surveillance d'une activation induite des RCPG G hétérotrimériques protéines dans des cellules vivantes simples. 4. Imagerie chimioattractive déclenché PIP dynamique ₃ réponses simples cellules vivantes en temps réel. Nos méthodes d'imagerie développée peut être appliquée à l'étude du chimiotactisme des leucocytes humains.

Protocole

1. Préparation du chimiotactisme des cellules compétentes de Dictyostelium discoideum

1. Pour générer des cellules D. discoideum qui sont chimiotactiques au camp chimiotactique, la récolte des cellules de plus en plus D3-t rich media à partir d'une culture en agitant à 22 ° C.
2. Laver les cellules deux fois en mémoire tampon non nutritifs développement (buffer DB contenant 5 mM Na ₂ HPO _4, 5 mM KH ₂ PO _4, MgCl2 ₂ mM, 0,1 mM CaCl et _2).
3. Re-suspendre les cellules dans un tampon de DB à une densité de 2x10 ⁷ cellules / ml.
4. Agiter 10 ml de cellules da....

Discussion

Le processus d'atteindre l'étape chimiotactiques compétentes des cellules

Pour type sauvage D. cellules discoideum, il faut environ 5 ~ 6 heures pulsation de développement à la température ambiante pour les inciter à une étape bien chimiotactiques compétents au cours de laquelle les cellules présentent une morphologie bien polarisée cellulaire et la migration cellulaire rapide (Fig. 1). Plusieurs facteurs, tels que la concentration d'AMPc d'impulsions, de la te.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Médias croissance D3-T	KD médicale
La caféine	Sigma
Latrunculin B	Molecular Probes
Alexa 594	Molecular Probes
AMPc	Sigma
ChronTrol XT minuterie programmable	ChronTrol Corp
Miniplus 3 pompe péristaltique	Gilbson
Platform agitateur rotatif
Approvisionnement FemtoJet pression microcapillaire	Eppendorf
Simple et quatre ainsi Lab-Tek II lamelle chambres	Nalge Nunc International
LSM 510 META ou équivalent microscope à fluorescence	Zeiss		une 40X 60X 1,3 NA ou NA 1.4 du pétrole lentilles DIC objectif du Plan-Neofluar
Olympus X81 ou équivalent	Olympus		Nécessite un 100X 1,47 NA TIRF lentille d'objectif