संवर्धित अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स एफएम रंगों का उपयोग करने में Synaptic पुटिका पूल पुनःपूर्ति के मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
एक जीवित प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक और केंद्रीय तंत्रिका टर्मिनलों में विशिष्ट synaptic पुटिका जुटाना पूल (एसवी) पुनःपूर्ति यों वर्णित है. एसवी रीसाइक्लिंग के दो दौर एक ही तंत्रिका एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान टर्मिनलों में निगरानी कर रहे हैं.
Abstract
After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools – the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.
Protocol
Discussion
एफएम रंजक बड़े पैमाने पर कई neuronal तैयारी में तंत्रिका टर्मिनल समारोह की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है. वे मुख्य रूप से नियोजित किया गया है या तो एसवी endocytosis, एसवी कारोबार या 6 exocytosis के कैनेटीक्स की हद पर नजर रखने के. वर्णित प्रोटोकॉल इन अध्ययनों का विस्तार विशिष्ट एसवी पूल की उतराई अंतर की जांच. यह अतिरिक्त एसवी पूल की पुनःपूर्ति और भी लामबंदी के अपने हद तक के बारे में जानकारी प्रदान करता है.
एफएम रंजक एक ही तंत्रिका टर्मिनल के भीतर एसवी रीसाइक्लिंग के कई दौर के लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इस संपत्ति का शोषण किया है और डिजाइन प्रोटोकॉल जिसमें प्रत्येक टर्मिनल में एसवी कारोबार एक ही तंत्रिका टर्मिनलों में दो बार निगरानी कर सकते हैं. यह एक सटीक आंतरिक नियंत्रण है, जो एसवी रीसाइक्लिंग के समानांतर तंत्रिका 11 टर्मिनलों में विषम प्रकृति के कारण आवश्यक है प्रदान करता है . Via एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में S1 चरण के उपयोग, RRP, आरपी और कुल के refillingदवाओं की उपस्थिति में एसवी पूल मज़बूती से और सीधे तुलना की जा सकती है.
रीसाइक्लिंग के पूर्ण आकार की जानकारी प्रदान करने के अलावा, RRP और आरपी पूल विभिन्न उत्तेजना की शर्तों के तहत, इस प्रोटोकॉल भी निम्नलिखित के लिए डेटा प्रदान कर सकते हैं – 1) RRP और आरपी के बीच SVS की रीसाइक्लिंग पूल के एक समारोह के रूप में विभाजन 2 S1 और S2, के लिए) S2 पूल के सापेक्ष कुल S1 रीसाइक्लिंग पूल और 3) किसी भी परिभाषित S1 में एक ही पूल के एक समारोह के रूप में S2 में एसवी पूल के सापेक्ष आकार के एक समारोह के रूप में आकार (RRP और आरपी). इस विशेष प्रोटोकॉल लेकिन कैनेटीक्स उतारने पर जानकारी प्रदान नहीं करता है, अधिग्रहण के समय के बाद से बहुत धीमी है (गतिज माप के लिए अधिग्रहण के समय के रूप में संभव है और स्वचालित रूप से उतारने छवि पर कब्जा करने के लिए सिंक्रनाइज़ के रूप में तेजी से होना चाहिए).
हमारे 30 हर्ट्ज 2 एस उत्तेजनाओं RRP के अतिपरासारी 8 sucrose के एक समान हद तक उतारने के उदाहरण भी देते हैं . RRP के आकार के बाद सेअतिपरासारी 15 उतराई sucrose के द्वारा परिभाषित है, हम है कि इस प्रोटोकॉल unloads सभी RRP SVS hippocampal 16 न्यूरॉन्स में पढ़ाई के साथ समझौते में, राज्य कर सकते हैं . आरक्षित पूल लगभग 400 उत्तेजनाओं (40 हर्ट्ज 10 प्रत्येक) इस उत्तेजना के बाद से (50 मिमी KCl के साथ 2 उत्तेजनाओं) प्रतिमान है कि सभी डाई लेबल SVS के 95% depletes डाई का एक समान राशि unloads के तीन गाड़ियों द्वारा पूरी तरह समाप्त हो गया है 8,17. दोनों RRP और आरक्षित पूल के आकार की सटीक मात्रा का ठहराव भी सीसीडी कैमरे के रैखिक गतिशील रेंज के भीतर जानकारी प्राप्त करने पर निर्भर है.
यह सरल प्रोटोकॉल आगे भी संशोधित किया जा सकता है. लोड हो रहा है उत्तेजनाओं की ताकत भी निर्धारित करने के लिए कैसे neuronal गतिविधि और विभिन्न endocytosis मोड एसवी पूल पुनःपूर्ति प्रभावित विविध किया जा सकता है. इसके अलावा, लदान और उतराई की दो से अधिक चक्र भी यदि आवश्यक प्रदर्शन किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल को भी या तो overexpression या के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता हैshRNA वैक्टर. प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के कम अभिकर्मक दक्षता के कारण, व्यक्त प्रोटीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग होना चाहिए. यह आवश्यक है कि इन फ्लोरोसेंट टैग एफएम डाई संकेत के साथ हस्तक्षेप नहीं (सियान या लाल प्रोटीन उदाहरण के लिए, का उपयोग करें). इस उदाहरण में, देखने का एक ही क्षेत्र में ट्रांसफ़ेक्ट और गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से तंत्रिका टर्मिनलों भी एक अतिरिक्त 8 नियंत्रण के रूप में तुलना में किया जा सकता है. ऐसे प्रयोगों में S1 और S2 भार के बीच लोड करने की हद तक की तुलना में कम मूल्य का है, के बाद से दोनों भार के दौरान गड़बड़ी मौजूद है. एसवी पूल डाई के बीच का विभाजन अभी भी 8 तथापि visualized किया जा सकता है .
जेनेटिक संवाददाताओं से कहा जाता है pHluorins भी एसवी और प्राथमिक neuronal संस्कृति में exocytosis endocytosis की निगरानी करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. ये जांच खलनायिका, synaptophysin और VGLUT1 18 के रूप में टैग एसवी प्रोटीन की luminal डोमेन के पीएच पर्यावरण के लिए एक pH-संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग </sup>. जब कोष्ठकी ATPase inhibitors के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, pHluorins एसवी पूल जुटाना 19 के दोनों और कैनेटीक्स हद तक रिपोर्ट कर सकते हैं. एफएम डाई आधारित दृष्टिकोण यहाँ वर्णित pHluorin तकनीक पर कुछ फायदे हैं, सबसे पहले, एफएम रंजक जानकारी है जिस पर एसवी endocytosis मोड RRP और रिजर्व 8 पूल replenishes प्रदान करते हैं. दूसरे विशिष्ट एसवी पूल एफएम रंजक है कि विभिन्न वर्णक्रमीय गुण है 20 और अंत में वहाँ अभिकर्मक के लिए कोई आवश्यकता नहीं है के साथ लेबल किया जा सकता है. एफएम रंजक आराम और एसवी पूल लेकिन रीसाइक्लिंग (19 pHluorins विपरीत) के बीच एसवी यातायात पर जानकारी उपलब्ध नहीं है, परिभाषा SVS द्वारा के बाद से डाई के साथ दिखाई जा endocytosis के दौरान लोड कर सकते हैं. इस प्रकार दोनों एफएम रंजक और pHluorins शक्तियों और कमजोरियों है और सबसे शक्तिशाली जब स्वतंत्र प्रयोगों में उपयोग करने के लिए एक ही सवाल को संबोधित कर रहे हैं.
उच्च गुणवत्ता छवियों मान्य विश्लेषण और reproducib के लिए आवश्यक हैंले परिणाम. जबकि क्षैतिज बहाव आसानी से सुधारा जा सकता है है, प्रयोगों जहां Z-अक्ष में एक बहाव है बरामद नहीं किया जा सकता है. इस कारण से, यह महत्वपूर्ण है S1 और S2 unloads शुरू करने से पहले छवियों को फिर से ध्यान केंद्रित. मामलों में जब एक महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट क्षय हुआ है, क्षय सुधार लागू किया जा सकता है (आमतौर पर एफएम लोड कोशिकाओं से उत्तेजना के अभाव में पहले से दर्ज ट्रेस subtracting द्वारा). हालांकि, यह सुझाव दिया है कि क्षय सुधार ग्राफिकल प्रतिनिधित्व नहीं है और किसी भी मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा के लिए ही किया जाता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वेलकम ट्रस्ट (रेफरी: 084277) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalogue no. |
|---|---|---|
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
| Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
| Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
| Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
| Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
| Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
| Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
| Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
| Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Solution B | – | – | 19 ml |
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Solution C | – | – | 3.2 ml |
| Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | – | – | 10 ml |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
| Name | Version | Company |
|---|---|---|
| AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
| ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
| Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)
References
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
