En live fluorescens billedbehandling teknik til at kvantificere opfyldning og mobilisering af specifikke synaptiske vesikel (SV) pools i det centrale nerve terminaler er beskrevet. To runder med SV genanvendelse overvåges i samme nerve terminalerne leverer en intern kontrol.
Efter neurotransmitter release i det centrale nerve terminalerne, er SVS hurtigt hentes af endocytose. Hentet SVS er derefter fyldes med neurotransmitter og genindtræde i genbrug pulje, der defineres som SVS, der er tilgængelige for exocytose 1,2. Genanvendelsen pool kan generelt opdeles i to forskellige puljer – det er let frigøres pool (vejl. udsalgspris) og reserven pool (RP). Som deres navne indebærer, RRP består af SVS, der er umiddelbart tilgængelige for fusion, mens RP SVS er kun udgivet under intens stimulation 1,2. Det er vigtigt at have en pålidelig analyse, der rapporterer den differentierede genopfyldning af disse SV puljer med henblik på at forstå, 1) hvordan SVS trafikken efter forskellige former for endocytose (såsom clathrin-afhængig endocytose og aktivitet-afhængige bulk endocytose) og 2) de mekanismer kontrollere mobilisering af både RRP og RP som reaktion på forskellige stimuli.
FM-farvestoffer er rutinemæssigt ansætteed til kvantitativt rapport SV omsætningen i det centrale nerve terminaler 3-8. De har en hydrofobe kulbrinte hale, der gør det muligt reversible partitionering i tolagede, og et hydrofilt hoved gruppe, der blokerer for passage over membraner. De farvestoffer har lidt fluorescens i vandig opløsning, men deres kvanteudbytte stiger dramatisk, når partitioneret i membran 9. Således FM-farvestoffer er ideelle fluorescerende prober til sporing aktivt genbrug SVS. Den standardprotokol for brug af FM-farvestof er som følger. Først de anvendes til neuroner og er taget op under endocytose (Figur 1). Efter ikke-internaliserede er skyllet vaek fra plasmamembranen, genbrugspapir SVS omfordele inden for genbrug pool. Disse SVS er derefter udtømte bruger losning stimuli (Figur 1). Siden FM-dye mærkning af SVS er kvantemekaniske 10, den resulterende fluorescens fald er proportional med mængden af frigivne blærer. Således genbrug og sammensmeltning af SVS genereret fra PRevious runde af endocytose kan opgøres pålideligt kvantificeres.
Her præsenterer vi en protokol, der er blevet ændret for at opnå yderligere to elementer af oplysninger. For det første er sekventiel losning stimuli bruges til varierende læsse RRP og RP, at tillade kvantificering af opfyldning af specifikke SV pools. For det andet, hver nerve terminal gennemgår protokollen to gange. Således kan svar af samme nerve terminal i S1 sammenlignes mod tilstedeværelsen af et teststof på fase S2 (figur 2), hvilket giver en intern kontrol. Dette er vigtigt, da omfanget af SV genbrug på tværs af forskellige nerve terminaler er meget variabel 11.
Enhver tilhænger primære neuronal kulturer kan anvendes til denne protokol, dog plating tæthed, løsninger og stimulation betingelser er optimeret til cerebellare granula neuroner (CGN) 12,13.
FM-farvestoffer er flittigt brugt til at undersøge nerveterminalreceptorer fungere i mange neuronal præparater. De har været ansat hovedsageligt til at overvåge omfanget af enten SV endocytose, SV omsætning eller kinetik exocytose 6. De beskrevne protokol udvider disse undersøgelser for at undersøge forskellen losning af specifikke SV pools. Dette giver yderligere oplysninger om genopfyldning af SV puljer og også deres omfanget af mobilisering.
FM-farvestoffer kan bruges til at mærke flere runder SV genanvendelse inden for samme nerve terminalerne. Vi har udnyttet denne ejendom og designet protokoller, hvor SV omsætning i hver terminal kan overvåges to gange i samme nerve terminalerne. Dette giver en nøjagtig intern kontrol, som er afgørende på grund af den heterogene karakter af SV genbrug parallelt nerveterminaler 11. Via brugen af S1 fase som en intern kontrol, påfyldning af RRP, RP og den samledeSV pool i overværelse af medicin kan opgøres pålideligt og direkte sammenlignes.
Ud over at give oplysninger i den absolutte størrelse af genbrug, under forskellige stimulation betingelser vejl. udsalgspris og RP puljer, kan denne protokol også levere data for følgende – 1) Den opdeling af SVS mellem den vejl. udsalgspris og RP som en funktion af genbrug pool til S1 og S2, 2) den relative størrelse af S2 puljer (vejl. udsalgspris og RP) som en funktion af samlet S1 genbrug pool og 3) den relative størrelse af en defineret SV pool i S2 som en funktion af den samme pulje i S1. Denne særlige protokollen, vil ikke give oplysninger om aflæsning kinetik dog siden overtagelsen tid er for langsom (for kinetisk målinger erhvervelse tider bør så hurtigt som muligt og aflæsning automatisk synkroniseret til billedoptagelse).
Vores 30 Hz 2 s stimuli fremkalder en identisk omfang af RRP losning til hypertoniske saccharose 8. Da størrelsen af RRPer defineret ved hypertonisk saccharose aflæsning 15, kan vi fastslå, at denne protokol losser alle RRP SVS, efter aftale med studier i hippocampus neuroner 16. Reserven pool er næsten helt forårsaget af tre tog af 400 stimuli (40 Hz 10 s hver), da denne stimulering losser et tilsvarende beløb af farvestof til et paradigme (2 stimuli med 50 mM KCl), at udtømning 95% af alle dye-mærkede SVS -8,17. Nøjagtig kvantificering af størrelsen af både RRP og reserver pool er også afhængig af at erhverve oplysninger inden for den lineære dynamiske område af CCD-kamera.
Denne enkle protokol kan også ændres yderligere. Styrken ved lastning stimuli kan også varieres for at bestemme, hvordan neuronal aktivitet og forskellige endocytose tilstande påvirker SV pool genopfyldning. Desuden kan mere end to cyklusser af lastning og losning også udføres, hvis det kræves. Denne protokol kan også bruges i celler transficeret med enten overekspression ellershRNA vektorer. På grund af den lave transfektion effektivitet primære neuronale kulturer, må udtrykte proteiner blive mærket med fluorescerende proteiner. Det er vigtigt, at disse fluorescerende tags ikke griber ind med FM-farve-signalet (brug cyan eller rød proteiner, for eksempel). I dette tilfælde kan nerveterminaler fra transficeret og ikke-transfekteret celler i samme synsfelt også sammenlignes som en ekstra kontrol 8. I sådanne forsøg en sammenligning af omfanget af lastning mellem S1 og S2 belastninger er af ringe værdi, da den forstyrrelse er til stede under begge belastninger. Opdeling af farvestof mellem SV puljer stadig kan visualiseres dog 8.
Genetiske journalister kaldte pHluorins kan også være ansat til at overvåge SV exocytose og endocytose i primære neuronale kultur. Disse sonder bruge en pH-følsom grønt fluorescerende protein til pH miljø luminale domæner tagged SV proteiner såsom VAMP, synaptophysin og VGLUT1 18 </sup>. Når det bruges sammen med vesikulær ATPase hæmmere, kan pHluorins rapportere både kinetik og omfanget af SV pool mobilisering 19. FM-dye tilgang, der er beskrevet her, har nogle fordele i forhold til pHluorin teknik, det første, FM-farvestoffer give oplysninger om, hvor SV endocytose tilstand fylder RRP og reservere pools 8. For det andet specifikke SV puljer kan være mærket med FM-farvestoffer, der har forskellige spektrale egenskaber, 20 og endelig er der intet krav om transfektion. FM-farvestoffer kan ikke give oplysninger om SV trafikken mellem hvile og genbrug SV puljer dog (i modsætning til pHluorins 19), da per definition SVS er nødt til at være belastet med farvestof under endocytose at være synlig. Således både FM-farvestoffer og pHluorins har styrker og svagheder og er mest magtfulde hvis det anvendes til uafhængige forsøg med at behandle det samme spørgsmål.
Billeder i høj kvalitet er afgørende for gyldige analyse og reproducible resultater. Mens vandret drift kan nemt rettes, kan forsøg, hvor der er et skred i Z-aksen ikke gendannes. Af denne grund er det vigtigt at re-fokusere billeder, før påbegyndelse af S1 og S2 losser. I tilfælde, hvor en betydelig fluorescerende forfald er indtruffet, kan der korrigeres for henfald (normalt ved at trække en tidligere optaget spor fra FM-loaded celler i fravær af stimulation). Dog foreslås det, at forfald korrektion kun udføres til grafisk repræsentation og ikke bruges til kvantitativ analyse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Wellcome Trust (Ref: 084277).
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)