En live fluorescens bildteknik för att kvantifiera påfyllning och mobilisering av specifika synaptiska vesikler (SV) pooler i centrala nervterminalerna beskrivs. Två omgångar av SV återvinning följs i samma nervterminalerna ger en intern kontroll.
Efter frisättningen av neurotransmittorer i centrala nerv terminaler är SVS snabbt hämtas av endocytos. Hämtad SVS fylls sedan på med signalsubstans och återförenas med återvinning poolen, definierat som SVS som är tillgängliga för exocytos 1,2. Återvinning poolen kan generellt delas upp i två olika bassänger – den lätt öppningsbara poolen (rek.) och reserven poolen (RP). Som deras namn antyder, består rek av SVS som är omedelbart tillgängliga för fusion, medan RP SVS frigörs bara under intensiv stimulering 1,2. Det är viktigt att ha en tillförlitlig analys som redovisar skillnaden påfyllning av dessa SV pooler för att förstå 1) hur SVS trafiken efter olika typer av endocytos (exempelvis clathrin beroende endocytos och aktivitet beroende bulk endocytos) och 2) de mekanismer kontrollera mobilisering av både RRP och RP som svar på olika stimuli.
FM-färgämnen anställa rutinmässigtgick till kvantitativt rapportera SV omsättning i centrala nervterminalerna 3-8. De har en hydrofob kolväte svans som gör att reversibla partitionering i membranet, och en hydrofil huvudet grupp som blockerar passagen över membran. Färgen har lite fluorescens i vattenlösning, men deras kvantutbyte ökar dramatiskt när partitionerad i membranet 9. Således FM-färgämnen är idealiska fluorescerande prober för att spåra aktivt återvinning SVS. Det standardprotokoll för användning av FM-färg är följande. Först de tillämpas på nervceller och tas upp under endocytos (figur 1). Efter icke-internaliserade färg har tvättats bort från plasmamembranet, återvunnen SVS omfördela inom återvinning poolen. Dessa SVS sedan utarmat med lossning stimuli (Figur 1). Eftersom FM färg märkning av SVS är quantal 10, är den resulterande fluorescensen släppa proportion till mängden av frigjort blåsor. Således genererade återvinning och sammanslagning av SVS från previous omgången av endocytos tillförlitligt kan kvantifieras.
Här presenterar vi ett protokoll som har modifierats för att få ytterligare två delar av information. För det första är sekventiella lossning stimuli som används för att differentiellt lossa rek och RP, för att möjliggöra kvantifiering av påfyllning av specifika SV pooler. För det andra genomgår varje nervändslutet protokollet två gånger. Således kan svaret från samma nerv terminalen på S1 jämföras mot förekomsten av ett testämne i fas S2 (Figur 2), vilket ger en intern kontroll. Detta är viktigt, eftersom omfattningen av SV återvinning i olika nervändar är mycket varierande 11.
Alla anhängare primära neuronala kulturer kan användas för detta protokoll, dock plätering densitet, lösningar och villkor stimulering är optimerade för cerebellär granulat neuroner (CGNs) 12,13.
FM-färgämnen används flitigt för att undersöka nervändslutet funktion i många neuronala förberedelser. De har använts främst för att kontrollera omfattningen av antingen SV endocytos, SV omsättningen eller kinetik exocytos 6. Den beskrivna protokollet utvidgar dessa studier för att undersöka den differentiella lossning av specifika SV pooler. Detta ger ytterligare information om påfyllnad av SV pooler och även deras omfattning mobilisering.
FM-färgämnen kan användas för att beteckna flera rundor av SV återvinning inom samma nervändslut. Vi har utnyttjat denna egenskap och utformade protokoll där SV omsättning i varje terminal kan övervakas två gånger i samma nervändslut. Detta ger en noggrann intern kontroll, vilket är nödvändigt på grund av den heterogena karaktären av SV återvinning parallellt nervterminalerna 11. Via användning av S1 fas som en intern kontroll, påfyllning av RRP, RP och den totalaSV pool i närvaro av läkemedel kan vara ett tillförlitligt och direkt jämföras.
Förutom att ge information om den absoluta storleken på återvinning, rek och RP pooler under olika stimulering förhållanden, kan detta protokoll ger också data för följande – 1) uppdelning av SVS mellan rek och RP som en funktion av återvinningsprocessen poolen för S1 och S2, 2) den relativa storleken på S2 pooler (rek. och RP) som en funktion av det totala S1 återvinning pool och 3) den relativa storleken på eventuella definieras SV pool i S2 som en funktion av samma pool i S1. Denna speciella protokoll kommer inte att ge information om lossning kinetik men eftersom förvärvet tiden är för långsam (för kinetisk mätning förvärv tider bör så snabbt som möjligt och lossning synkroniseras automatiskt att ta bilder).
Vår 30 Hz 2 s stimuli framkallar en identisk omfattning av RRP lossning till hyperton sackaros 8. Eftersom storleken på RRPdefinieras av hyperton sackaros lossning 15, kan vi konstatera att detta protokoll lossar alla rek SVS, i samförstånd med studier i hippocampus nervceller 16. Reservatet poolen är nästan helt slut av tre tåg av 400 stimuli (40 Hz 10 s vardera) eftersom detta stimulering lossar en identisk mängd färgämne för att ett paradigm (2 stimuli med 50 mm KCl) som utarmar 95% av alla färg-märkta SVS 8,17. Exakt kvantifiering av storleken på både RRP och reserv poolen är också beroende av att skaffa information inom det linjära dynamiska omfånget av CCD-kamera.
Denna enkla protokoll kan också ändras ytterligare. Styrkan för lastning stimuli kan också varieras för att avgöra hur neuronala aktivitet och olika lägen endocytos påverkar SV pool påfyllning. Dessutom kan mer än två cykler av lastning och lossning även utföras vid behov. Detta protokoll kan även användas i celler transfekterade med antingen överuttryck ellershRNA vektorer. På grund av den låga transfektion effektivitet primära neuronala kulturer måste uttryckta proteinerna vara märkta med fluorescerande proteiner. Det är viktigt att dessa lysrör taggarna inte stör FM-dye-signalen (använd cyan eller rött proteiner, till exempel). I detta fall kan nervändslut från transfekterade och icke-transfekterade celler i samma synfält även jämföras som en extra kontroll 8. I ett sådant experiment en jämförelse av graden av belastning mellan S1 och S2 laster är av ringa värde, eftersom den störning är närvarande under båda laster. Partitionering färgämne mellan SV pooler kan fortfarande visualiseras dock 8.
Genetiska reportrar kallas pHluorins också kan användas för att övervaka SV exocytos och endocytos i primära neuronala kultur. Dessa sonder använda en pH-känslig grönt fluorescerande protein för pH miljö luminala domäner taggade SV proteiner såsom VAMP, synaptophysin och VGLUT1 18 </sup>. När den används tillsammans med SVD ATPas-hämmare, kan pHluorins rapportera både kinetik och omfattning SV poolen mobilisering 19. FM-dye baserade tillvägagångssätt som beskrivs här har vissa fördelar över pHluorin tekniken, det första FM-färgämnen ge information om vilka SV endocytos läge fyller på rek och reservera pooler 8. För det andra specifika SV pooler kan märkas med FM-färgämnen som har olika spektrala egenskaper 20 och slutligen finns det inget krav för transfektion. FM-färgämnen kan inte ge information om SV trafiken mellan vila och återvinning SV pooler dock (i motsats till pHluorins 19), eftersom per definition SVS måste laddas med färgämne under endocytos att synas. Alltså både FM-färgämnen och pHluorins har styrkor och svagheter och är mest kraftfulla när de används i oberoende experiment för att ta upp samma fråga.
Bilder med hög kvalitet är avgörande för giltiga analys och reproducibLe resultat. Medan horisontella glida lätt kan korrigeras kan experiment där det finns en tendens i Z-axeln inte återställas. Av denna anledning är det viktigt att åter fokusera bilderna innan man börjar S1 och S2 lossar. I de fall när en betydande fluorescerande förfall har skett, kan sönderfallskorrigering tillämpas (vanligtvis genom att subtrahera ett tidigare inspelat spår från FM-laddade celler i avsaknad av stimulans). Däremot föreslås det att förfallet korrigering bara görs för grafisk representation och inte användas för något kvantitativ analys.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av ett bidrag från Wellcome Trust (Ref: 084.277).
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)