代谢物的浓度从低密度浮游社区的环境代谢，利用核磁共振光谱

Summary

从微生物浮游社区的代谢产物提取方法。抽样实现整个社会上特意准备的过滤器过滤。冷冻干燥后，溶于水，代谢产物中提取。这种方法用于环境代谢的自然或实验的微生物群落的跨组学研究中的应用。

Abstract

环境代谢组学是一个新兴的领域有了新的认识，促进生物体是如何应对和交互环境和对方在生化水平^1。核磁共振（NMR）光谱是多种技术，包括气相色谱 - 质谱（GC-MS法）之一，此类研究大有前途。核磁共振的优点是，它是适用于不相关的分析，提供结构化信息和光谱可以对最近^2,3个人代谢物谱数据库查询数量和统计的举止。此外，核磁共振光谱数据可与其他组学水平（如转录，基因组学）的数据，以提供更全面的了解类群的生理反应，彼此和环境^4,5,6。然而，核磁共振是比其他代谢组学技术的敏感，使其难以AP铺设天然微生物系统，样本人群低密度及代谢物浓度比较低的代谢物的定义和随时提取来源，如整个组织，biofluids或细胞培养。因此，一些直接环境日期进行微生物的代谢物的研究一直局限于文化为基础的或容易定义的高密度的生态系统，如主机的共生系统，构建联合培养或肠道内环境的稳定同位素标记可以操作此外用于增强核磁共振信号^{7,8,9,10,11,12。}核磁共振适合浓度的方法，促进环境代谢物的浓度和收集所缺乏的。由于近期关注已在水生环境，其中大部分能量和物质流介导由的浮游社区^13,14生物体对环境的代谢，我们已经开发出一种浓度的方法TION和全社会的代谢产物从浮游微生物系统过滤提取。市售亲水性的聚-1 ,1-difluoroethene（PVDF）过滤器是经过特殊处理，以彻底清除萃取物，可作为后续分析中的污染物，否则会出现。然后，这些治疗的过滤器用于过滤利益的环境或实验样品。湿样品材料的过滤器含有冻干和使用一个标准化的钾磷酸盐提取液常规核磁共振光谱直接溶于水的代谢产物中提取。可以从这些方法得出的数据进行统计分析，找出有意义的模式，或集成水平与其他组学为社会和生态系统功能的全面了解。

Protocol

1。过滤删除萃取物的制备

1. 使用25毫米直径0.22微米孔径Durapore PVDF（Millipore公司）亲水性过滤器。放置在一个干净的500毫升耐热烧杯过滤器，使用镊子。前用蒸馏水冲洗三次。漩涡以及你冲洗过滤器，以防止从坚持彼此。加入300毫升的Milli-Q（Millipore公司）或相当于高品质的水。釜萃取物彻底清除，以方便从过滤器。
2. 倒掉的Milli-Q和再次三重冲洗过滤器，这个时候用Milli-Q。使用镊子个人清洁干燥的表面（如铝箔），要么在一个合理的温度（例如37℃）或空气干燥干燥过滤器。现在可以使用过滤器。

2。过滤材料的样品

1. 玻璃支持这一协议，微孔不锈钢3就地过滤多方面展示与25毫米的微量过滤列使用机械泵。使用无菌操作技术，将一个单一的25毫米的过滤器，适用于过滤柱基列和取缔一起。
2. 列装入15毫升的样品，打开过滤器流形上的截止阀，并打开泵。温柔的压力下，过滤器，以减少细胞破损（<5千帕）。如手或蠕动泵，其他泵，可适应于本议定书。对于密度较低的样品，连续增加的水可能是必要的，不要让去添置水之间的时间间隔较长时间的干燥过滤器。
3. 海洋样品，你过滤你的样品后，您可以执行一个可选的淡水冲洗，以减少您的样品，并在过滤器上的残余顺磁离子。这可能有助于更精确调谐谱仪磁铁。只是轻轻地补充水分，体积小，并在年底通过您收集的样本进行筛选。
4. 一次过滤完成后，....

Discussion

这里展示的过滤和代谢产物提取方法允许在收集足够数量的核磁共振代谢微生物浮游生物。虽然只溶于水的使用KPI和1D ^{1 H}核磁共振的代谢产物提取证明，其他的提取溶剂和光谱方法可以使用。一个有用的例子是使用氘代甲醇作为一个半极性溶剂，这已被证明产生优越的核磁共振光谱，从异构样品及顺磁离子污染不敏感，在^15个海洋样品发现。在这种情况下，从上面提取的颗粒应保持连续提取。我们以前的工作表明在这样的孵育时间和温度和适宜的直接水提取核磁共振光谱^15,20光谱的稳定性。然而，研究人员可能还喜欢修改提取的步骤，例如，通过使用DENA图灵一步灭活酶前提取，或利用快速淬火的方法，从简单的冻结如下所示的细胞不同。此外，虽然这里介绍的方法最适合用于观察整个治疗代谢产物中的比例的变化，如果需要的话，过滤器可以预先称重，然后称重样品过滤和冻干后再次获得的干重，或过滤的样品体积可以用于获取更多的定量代谢物源数据。

浮游样品的核磁共振的效用，最终被限制的大规模量，可以成功地收集，即使是高密度的文化，可能需要大量（> 100毫升），以获得足够的干物.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
0.22μm的亲水性Durapore PVDF的过滤器，25毫米	Millipore公司	GVWP02500
微观滤镜托架，25毫米，熔块玻璃支持	Millipore公司	XX1002500
3地方多方面的，47毫米，不锈钢	Millipore公司	XX2504735
KH 2 PO 4	瓦科	169-04245
K 2 HPO 4	瓦科	164-04295
氧化氘，2 H> 90％;	campridge同位素Laboratoties	DLM - 4	>
决策支持系统	Fluka公司	92754
automill	tokken	TK-AM4	包括不锈钢粉碎机
thermomixer舒适	Eppendorf公司	5355 000.011
bioruptor	diagenode	UCD-200
真空蒸发器	EYELA	CVE - 3100
核磁共振	布鲁克	DRX-500 5毫米TXI探头
光谱分选工具	最初开发	FT2DB	https://database.riken.jp/ecomics/
代谢产物的注释工具和数据库	最初开发	SpinAssign	= nmr_search"> http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search