Koncentration av metaboliter från låg densitet Planktoniska gemenskapernas Miljö Metabolomics med Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Summary
En metod för metabolit extraktion från mikrobiella planktoniska samhällen presenteras. Hela samhället provtagning åstadkommas genom filtrering på speciellt beredd filter. Efter lyofilisering, är vatten-lösliga metaboliter extraheras. Detta tillvägagångssätt möjliggör tillämpningen av miljövänlig metabolomik till trans-Omics undersökningar av naturliga eller experimentell mikrobiella samhällen.
Abstract
Miljö metabolomik är ett framväxande fält som främjar ny förståelse i hur organismer svara på och interagera med omgivningen och varandra på biokemisk nivå 1. Kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är en av flera tekniker, inklusive gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), med stor lovande för sådana studier. Fördelar med NMR är att den är lämplig för oriktade analyser, ger strukturell information och spektra kan söka i kvantitativa och statistiska sätt mot senast tillgängliga databaser för enskilda metaboliten spektra 2,3. Dessutom kan NMR-data kombineras med data från andra Omics nivåer (t.ex. transkriptomik, genomik) för att ge en mer heltäckande förståelse av de fysiologiska svaren från taxa till varandra och miljön 4,5,6. Emellertid är NMR mindre känsliga än andra metabolomic tekniker, vilket gör det svårt att apskikt av naturliga mikrobiella system där prov populationer kan vara låg densitet och metabolit koncentrationer låg jämfört med metaboliter från väl definierade och lätt extraherbara källor som hela vävnader, Biofluids eller cell-kulturer. Följaktligen har de få direkta miljö metabolomic studier av mikrober som utförts hittills varit begränsad till kultur-baserade eller enkelt definieras med hög densitet ekosystem som värd-symbiont system, konstruerade co-kulturer eller manipulationer av tarmen miljö där stabila isotopen märkning kan dessutom användas för att förbättra NMR signaler 7,8,9,10,11,12. Metoder som underlättar koncentrationen och samlingen av miljömässiga metaboliter vid koncentrationer som är lämpliga för NMR saknas. Eftersom den senaste tidens uppmärksamhet har ägnats åt de miljömässiga metabolomik för organismer i vattenmiljön, där mycket av den energi och materialflödet förmedlas av plankton samhället 13,14, har vi utvecklat en metod för koncentrationenning och utvinning av hela samhället metaboliter från system planktoniska mikrobiella genom filtrering. Kommersiellt tillgängliga hydrofila poly-1 ,1-difluoroethene (PVDF)-filter är speciellt behandlad för att fullständigt avlägsna extraherbara, som annars kan förekomma som föroreningar i efterföljande analyser. Dessa behandlade filtren används sedan för att filtrera miljö eller experimentella prover av intresse. Filter innehåller det våta provet materialet är frystorkat och vattenlösliga metaboliter utvinns direkt för konventionella NMR-spektroskopi med hjälp av en standardiserad kaliumbuffert fosfat utvinning 2. Uppgifter som härrör från dessa metoder kan analyseras statistiskt för att identifiera meningsfulla mönster eller integreras med andra Omics nivåer för förståelse av gemenskap och ekosystemens funktion.
Protocol
Discussion
Filtrering och metabolit extraktionsmetod visas här möjliggör mikrobiell planktoniska biomassa som skall samlas in i tillräcklig mängd för NMR metabolomik. Medan endast extraktion av vattenlösliga metaboliter med KPI och 1D 1 H-NMR visas, kan andra extraktionsmedel och spektroskopiska metoder användas. Ett användbart exempel är användningen av deutererad metanol som ett halvfast polärt lösningsmedel, som har visat sig ge överlägsen NMR-spektra från heterogena prov och är mindre känslig för …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds delvis av Grants-i-Stöd till vetenskaplig forskning för att utmana explorativ forskning (JK), och vetenskaplig forskning (A) (JK och SM) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan . En RIKEN FPR gemenskap (RKS) gav ytterligare stöd. Författarna uttrycker sin tacksamhet till Dr. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama och Mami Okamoto för tekniskt bistånd med NMR och statistiska analyser.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new ‘omics’ on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- Eldon, L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
