Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har potentialet til at behandle et utal af forskellige sygdomme. Anvendeligheden af disse celler består i det faktum, at de kan differentiere til enhver celletype i legemet. Her beskriver vi teratom assay, som anvendes til at påvise pluripotence af hPSCs.
Pluripotente stamceller (PSC) har den unikke egenskab, at de kan differentiere til celler fra alle tre kimlag. Dette gør dem potentielt værdifuldt redskab til behandling af mange forskellige sygdomme. Med fremkomsten af inducerede pluripotente stamceller (IPSC'er) og fortsatte forskning med menneskelige embryonale stamceller (hESCs) der er behov for analyser, der kan påvise, at en bestemt cellelinje er pluripotente. Kimlinjeoverførsel er guldstandarden for at demonstrere pluripotence af muse embryonale stamceller (mESC) linjer 1,2,3. Ved hjælp af dette assay, kan forskerne viser, at en mESC linje kan gøre alle celletyper i embryoet herunder kimceller 4. Med genereringen af human ESC linier 5,6, var den passende assay for at bevise pluripotence af disse celler uklar, da humane ESC ikke kan testes for kimlinietransmission. Som et surrogat er teratom assayet for tiden anvendes til at påvise pluripottighed af menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) 7,8,9. Selvom denne analyse for nylig er kommet under kontrol, og nye teknologier er ved at blive aktivt udforskes, den teratom analysen er den nuværende guldstandarden 7. I dette assay bliver cellerne pågældende injiceres i et immunkompromitteret mus. Hvis cellerne er pluripotente, vil et teratom tiden udvikle og dele af tumoren vil vise væv fra alle 3 kimlag 10. I teratom assayet, kan hPSCs injiceres i forskellige områder af musen. De mest almindelige injektionssted omfatter testis kapslen, nyrekapslen, leveren eller i benet enten subkutant eller intramuskulært 11. Her beskriver vi en robust protokol for produktion af teratomer fra hPSCs anvender testis kapslen som stedet for tumorvækst.
Metoden præsenteres her giver en yderst pålidelig og enkel måde at generere teratomer fra hPSCs i testiklerne kapslen. Der er adskillige kritiske parametre i denne teknik. I særdeleshed er det vigtigt at injicere hPSC cellelinier, som vides at være pluripotent som en kontrol. Andre vigtige parametre indbefatter tidsintervallet mellem injektion og tumor observation. For cellelinjer, såsom WA09 skal teratomer observeres i 6-8 uger. For nye IPSC linjer, vi finder der ofte 10 uger er påkrævet. En anden bekymring er antallet af injicerede celler. Vi injicere en million celler, men assayet kan let gøres med færre celler. Desuden er injektion medium vigtig. Vi finder, at vi får de bedste resultater, når cellerne injiceres i en 1:1 blanding af matrigel og DMEM/F-12, i modsætning til PBS eller DMEM/F-12.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af CIRM tilskud # TR-1250, RT1-01.108, og CL1-00.502.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Accutase | Invitrogen | A1110501 |
DMEM/F-12 | Invitrogen | 113300-032 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |