Quantifier l'activité agoniste à G récepteurs couplés aux protéines

Summary

Une méthode d'estimation de la constante d'affinité d'un agoniste de l'état actif (<em> K<sub> B</sub</em>) D'un G récepteurs couplés aux protéines est décrite. L'analyse fournit des mesures absolues ou relatives de<em> K<sub> B</sub</em> Selon que l'activation du récepteur constitutif est mesurable. Notre méthode s'applique à divers aval des réponses de l'activation du récepteur.

Abstract

Quand un agoniste active une population de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), il provoque une voie de signalisation qui aboutit à la réponse de la cellule ou de tissu. Ce processus peut être analysé au niveau d'un récepteur unique, une population de récepteurs, ou une réponse en aval. Nous décrivons ici comment analyser la réponse en aval pour obtenir une estimation de l'affinité agoniste constante de l'état actif des récepteurs simples.

Récepteurs comportent comme des interrupteurs quantiques qui alternent entre les états actifs et inactifs (figure 1). L'état actif interagit avec les protéines G spécifiques ou d'autres partenaires de signalisation. En l'absence de ligands, l'état inactif prédomine. La liaison de l'agoniste augmente la probabilité que le récepteur va passer en l'état actif car sa constante d'affinité pour l'état actif (K _b) est beaucoup plus grande que pour l'état inactif _(K). La sommation dessorties aléatoires de l'ensemble des récepteurs de la population donne un niveau constant de l'activation du récepteur dans le temps. L'inverse de la concentration d'agoniste provoquant l'activation du récepteur demi-maximale est équivalente à la constante d'affinité observée _(Kobs), et la fraction d'un agoniste des récepteurs complexes à l'état actif est défini comme l'efficacité (ε) (figure 2).

Méthodes pour l'analyse des réponses en aval de RCPG ont été développés qui permettent l'estimation de la _Kobs et l'efficacité relative d'un agoniste ^1,2. Dans ce rapport, nous montrons comment modifier cette analyse pour estimer l'agoniste K _b valeur par rapport à celle d'un autre agoniste. Pour les essais qui présentent une activité constitutive, nous montrons comment estimer K _b en unités absolues de M ^-1.

Notre méthode d'analyse agoniste courbes concentration-réponse consiste ^3,4de régression non linéaire globale en utilisant le modèle opérationnel ^5. Nous décrivons une procédure utilisant le logiciel d'application, Prism (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA). L'analyse donne une estimation du produit de _Kobs et un paramètre proportionnel à l'efficacité (τ). L'estimation de τK _obs d'un agoniste, divisé par celui d'une autre, est une mesure relative de K _b (AR _I) ^6. Pour tout récepteur présentant une activité constitutive, il est possible d'estimer un paramètre proportionnel à l'efficacité du complexe récepteur libre (τ _sys). Dans ce cas, la valeur de K _b d'un agoniste est équivalent à τK _obs / τ _système ^3.

Notre méthode est utile pour déterminer la sélectivité d'un agoniste des récepteurs de sous-types et pour quantifier agoniste des récepteurs de signalisation par les protéines G différentes.

Protocol

1. Mesure de l'agoniste de courbes concentration-réponse: aucune activité constitutive Pour l'estimation des valeurs relatives agoniste b K (AR I), une série d'au moins deux agonistes courbes concentration-réponse est nécessaire. Tout test in vitro pour la réponse fonctionnelle d'un RCPG peut être mesuré à condition que la concentration d'agoniste peut être contrôlé et un seul type de récepteur médie la réponse. Convient dosag…

Discussion

Parce que notre méthode d'estimation de la Région _I (relatif K valeur _b) exige que la mesure de l'agoniste courbes concentration-réponse, notre analyse peut être faite n'importe quand ces courbes sont mesurées.

Si au jour le jour variation de la réponse de la préparation expérimentale (par exemple, des cellules ou tissus) est grande, les mesures de réponse de chaque courbe concentration-réponse peut être normalisée par rapport à la …