Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz
Summary
Kafesli bileşiklerin Fotoliz çeşitli fizyolojik aktif bileşiklerin konsantrasyonu hızlı ve yerelleştirilmiş artar üretimi sağlar. Burada, kafesli cAMP fotoliz ile kombine veya ayrışmış bir fare koku alma duyusal nöronlarda koku iletimi çalışma için Ca kafesli patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir.
Abstract
Kafesli bileşiklerin Fotoliz hızlı ve yerelleştirilmiş çeşitli fizyolojik olarak aktif bileşikler 1 konsantrasyonu artar üretimi sağlar. Kafesli bileşikler, ultraviyole ışığın bir flash kırılmış olabilir kimyasal bir kafes tarafından fizyolojik olarak inaktif hale moleküllerdir. Burada, ayrışmış fare koku alma duyu nöronlar koku iletimi çalışması için kafesli bileşiklerin fotoliz ile birlikte patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir. Reseptörlerine bağlanarak odorant siklik nükleotid kapılı (CNG) kanal 2 açılır cAMP artışına yol açan koku alma duyu nöronlar, kirpikler, koku alma transdüksiyon işlemi (Şekil 1) yer alır . Ca CNG kanallar aracılığıyla giriş aktive Ca-Cl kanalları harekete geçirir. Biz, fare olfaktör epitel 3 ve kafesli cAMP 4 fotoliz veya Ca 5 kafesli CNG kanalları ya da Ca-aktive Cl kanalları nasıl aktif hale getirmek için nöronların nasıl ayırmak </> Destek. Biz tam hücreli gerilim kelepçe yapılandırma 8-11 patch-klemp kayıtları mevcut ölçmek için alınır uncage cAMP veya Ca ultraviyole yanıp söner siliyer bölgeye uygulamak için bir flash lamba 6,7 kullanın.
Protocol
Discussion
Patch-klemp kayıtları ile birlikte kafesli bileşiklerin Flash fotoliz konsantrasyonu fizyolojik olarak aktif moleküllerin hem iç ve dış hücreleri hızlı ve yerel atlar elde etmek için çok kullanışlı bir tekniktir. Kafesli compounds1 çeşitli türlerde sentezlenen olmuştur ve bu tekniğin, kültür hücreleri aktive olabilir veya bazı kafesli bileşikler 11 fotoliz tarafından modüle iyon kanalları ifade de dahil olmak üzere hücreleri, çeşitli türleri için uygulanabilir.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom made | ||
| Filter cube | Olympus | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML |
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cysteine | Sigma | C9768 |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAse I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glucose | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptin | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papain | Sigma | P3125 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
References
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M., Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. , (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
