Summary

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Published: September 17, 2011
doi:

Summary

Eine Methode, um translationsaktiven, intakte Synaptoneurosomen (SNS) von der Maus Hirnrinde vorbereiten beschrieben. Das Verfahren nutzt eine diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Dies ermöglicht die schnelle Erstellung von aktiven SNS.

Abstract

Synaptoneurosomen (SNS) sind nach der Homogenisierung und Fraktionierung von Maus Hirnrinde erhalten. Sie sind Vesikel oder isolierte Terminals, die ausbrechen aus Axonterminalen wenn die kortikale Gewebe wird homogenisiert und verschließen. Die SNS behält prä-und postsynaptischen Eigenschaften, wodurch sie sinnvoll in das Studium der synaptischen Übertragung. Sie behalten die molekulare Maschinerie in neuronalen Signalübertragung verwendet und sind in der Lage die Aufnahme, Speicherung und Freisetzung von Neurotransmittern.

Die Herstellung und Isolierung von aktiven SNs kann problematisch mit Medien wie Ficoll, die zytotoxisch können und müssen verlängert Zentrifugation aufgrund der hohen Dichte und Filtration und Zentrifugation Methoden, die in geringer Aktivität durch eine mechanische Beschädigung der SNS können die Folge sein. Allerdings ist die Verwendung von diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten an SNS isolieren eine schnelle Methode, um gute Ausbeuten an translationsaktiven SNs produzieren. Die Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode ist schnell und sanft wie es isotonischen Bedingungen beschäftigt, hat weniger und kürzere Zentrifugation Spins und vermeidet Zentrifugationsschritte, dass Pellet SNs und mechanische Schäden verursachen.

Protocol

1. Die Vorbereitungen 1-4 Bereiten Sie 500 mL Gradienten-Medium (GM)-Puffer durch Mischen von 50 mL einer 2,5 M Saccharose Gülle, 2,5 mL einer 1M Tris-HCl, pH 7,5 Lager, und 0,1 ml einer 0,5 m EDTA, pH 8,0 Lager mit Milli- Q-Wasser, um die Lautstärke. Filter sterilisieren die Lösung, Aliquot und speichern eingefroren. Bereiten Sie eine 1000x Lager von Tetrodotoxin (TTX), indem Sie eine 1 mM Lösung in Milli-Q-H 2 O. Aliquots der TTX kann bei -20 ° C gelagert werden <li…

Discussion

Die diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Gradienten Vorbereitung hierin beschriebenen ist eine schnelle, zuverlässige Methode, um aktiv SNS, die in einer Vielzahl von synaptischen Übertragung Experimente verwendet werden können isolieren. Dieser Gradient-Methode, die auf der Methode von Dunkley et al., 3,4 entwickelten, ist eine subzelluläre Fraktionierung Gehirn Verfahren, das sowohl prä-und postsynaptischen Membran-derived Bläschen, die miteinander verbunden sind, isoliert. Ohne weitere Reinigung die…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten BK August von der University of Wisconsin-Madison Electron Microscope Facility für die Elektronenmikroskopie danken. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01-DA026067 und P30-HD03352 (bis JSM) unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce 23235  
CaCl2 Fisher C79-500  
CO2 gas Airgas (UW-MDS) CD 50  
EDTA RPI E57020  
EtOH Fisher A407SK-4  
HCl Fisher A142-212  
Percoll GE Healthcare 17-0891-01  
KH2PO4 Fisher P285-500  
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit Pierce 89888  
NaCl RPI S23020  
NaHCO3 Fisher BP328-500  
Na2PHO4 Fisher S381-500  
Sucrose RPI S24060  
Tris Base RPI T60040  
Tetrodotoxin Sigma T5651  
Express Pro Label Mix S35 Easy Tag Perkin Elmer NEG772  
       
Equipment Company Catalogue number Comments (optional)
Dissection tools      
Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled ” A” and “B”) Wheaton    
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602  
Allegra 6KR Centrifuge Beckman Coulter 366830  
GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor Beckman Coulter 360581  
Beckman J2-21 Centrifuge Beckman    
Beckman tubes with caps Beckman 355672  
White walled adapters Beckman 342327  
Blue walled adapters Beckman    
JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor Beckman 369691  

Table of antibodies used for western blots:

Name of Antibody Company Catalogue number Host Species Dilution Factor
β-Actin Sigma A5441 mouse 1:2000
GFAP Santa Cruz sc-65343 mouse 1:200
GP73 Santa Cruz Sc-134509 rabbit 1:200
HSC70 Santa Cruz sc-7298 mouse 1:200
Laminβ Santa Cruz Sc-6261 goat 1:200
Prohibitin Santa Cruz sc-28259 rabbit 1:200
PSD95 Millipore MAB1596 mouse 5 μg/μL
SNAP25 AbCam ab5666-100 rabbit 1:2000
Synaptophysin Millipore MAB368 mouse 1:500
β-3-Tubulin Santa Cruz sc-80016 mouse 1:200

References

  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O’Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
  3. Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
  4. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  5. Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3′:5′-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
  6. Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
  7. Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
  8. Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
  9. Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
  10. Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
  11. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
  12. Li, K. -. W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
  13. Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
  14. Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer’s amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
  15. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
  16. Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
  17. Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
  18. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  19. Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
  20. Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
  21. Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
  22. Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
  23. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
  24. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
  25. Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
  26. Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
  27. Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
  28. Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
  29. Pertoft, H., Laurent, T. C., Catsimpoolas, N. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. , 25-65 (1977).
  30. Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and &gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
  31. Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
  32. Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. Cell separation composition, kit and method. US patent. , (1997).

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Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J. Vis. Exp. (55), e3196, doi:10.3791/3196 (2011).

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