Längsgående Utvärdering av Mouse bakbenen benförlust efter ryggmärgsskada med Novel, In vivo, Metodik

Summary

En longitudinell undersökning av benförlust i lårben och tibiae av vuxna möss utfördes efter ryggmärgsskada med sekventiella låg dos röntgen skanningar. Tibia benförlust upptäcktes under hela studien, medan förlust av benmassa i lårbenet inte upptäcks förrän 40 dagar efter skada.

Abstract

Ryggmärgsskada (SCI) åtföljs ofta av osteoporos i sublesional regioner i bäckenet och nedre extremiteterna, vilket leder till en högre frekvens av frakturer ^1. Eftersom dessa frakturer ofta förekommer i regioner som har förlorat normal sensorisk funktion, är patienten en ökad risk för frakturer beroende patologier, inklusive dödsfall. SCI-beroende förlust i både bentäthet (BMD, gram / ​​cm ²⁾ och benmineralinnehåll (BMC, gram) har tillskrivits mekaniska glömska ^2, avvikande neuronal signalering ³ och hormonella förändringar ^4. Användningen av gnagare modeller av SCI-inducerad osteoporos kan ge ovärderlig information om mekanismerna bakom utvecklingen av benskörhet efter SCI samt en testmiljö för generering av nya terapier ^5-7 (och ses över i ^8). Musmodeller av SCI är av stort intresse eftersom de tillåter ett reduktionistiskt förhållningssätt till mekanism-based bedömning med hjälp av null och transgena möss. Även om sådana modeller har gett viktiga uppgifter, finns det fortfarande ett behov av minimalinvasiv, pålitlig, reproducerbar, och mätbara metoder för att fastställa omfattningen av benförlust efter SCI, särskilt över tid och inom samma kohort av försöksdjur, att förbättra diagnostik , behandlingsmetoder och / eller förebyggande av SCI-inducerad osteoporos.

En idealisk metod för att mäta bentätheten hos gnagare skulle tillåta flera, sekventiell (över tiden) exponering för låga nivåer av röntgenstrålning. Denna studie beskriver användningen av en ny hel-animaliska skannern, IVIS Lumina XR (Caliper instrument) som kan användas för att ge låg energiförbrukning (1-3 milligray (mGy)) hög upplösning, hög förstoring röntgenbilder av mus bakbenen ben över tid efter SCI. Betydande bentäthet förlust sågs i tibiae av möss med 10 dagar efter spinal transection jämfört med oskadd, åldersmatchade kontroll (naiva) möss (13% minskning, p <0,0005). Förlust av bentäthet i distala femur också upptäckas vid dag 10 post-SCI, medan en förlust av täthet i proximala lårbenet var inte upptäckas förrän 40 dagar efter skadan (7% minskning, p <0,05). SCI-beroende förlust av mus lårbenet densitet bekräftades efter slakt med hjälp av Dual-energi röntgen (DXA), den nuvarande "gyllene standard" för mätning av bentäthet. Vi upptäcka en 12% förlust av BMC i lårben hos möss vid 40 dagar efter SCI använder IVIS Lumina XR. Det kan jämföras med ett tidigare rapporterat BMC förlust på 13,5% av Picard och kollegor som används DXA analys på musen lårben post mortem 30 dagar efter SCI ^9. Våra resultat tyder på att IVIS Lumina XR erbjuder en roman, high-resolution/high-magnification metod för att utföra långsiktiga, longitudinella mätningar av bakbenen bentätheten i musen efter SCI.

Protocol

1. Mus spinal transection modell Vuxen, manlig, C57BL6 möss (ca 20-25 g) bedövas med en kombination av ketamin (200 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Alla kirurgiska ingrepp utförs i ett institutionellt, IACUC-godkända kirurgisk svit under sterila förhållanden. När djupt sövda är pälsen på ryggen trimmas med hjälp av elektrisk klippare. Den rakade rygg är först skrubbas med en jodlösning följt av 70% etanol. Före den första snittet är området av ryggen som ska snittas first infiltrerade med lokalbedövning (Marcaine) vid en koncentration på (0,25%, <1ml/kg) för att minimera postoperativ smärta. Med små saxar, är en liten öppning görs i huden på runt L2 området. Denna öppning utökas med samma uppsättning av saxar, som sträcker sig längs med T2 området. Kanterna på huden då hålls isär via användning av bulldog klämmor. Micro-sax används sedanatt rensa muskelvävnad från rygg spinal lamina på bröstkorg nivå 8 (T8). T8 kan identifieras som beskrivs i Kuh och Wrathall (1998) 10. Kortfattat kan T13 identifieras genom dess rygg ryggkotornas process. Använda ett par # 5 Dumont pincett, kan det sista revbenet palperas / identifieras och räknas tillbaka till T8. När rensas, ben Rongeurs används för att utföra en rygg laminektomi på T8. Fullständig Spinal transection Lesion: När ryggmärgen utsätts på T8, ytterligare en uppsättning steriliserade mikro-sax används för att avskilja ryggmärgen i planet vinkelrätt mot den långa axeln i snodden under en kirurgisk mikroskop. Vi använder # 5 Dumont pincett för att försiktigt lyfta ena polen i ryggmärgen att bekräfta fullständighet lesionen. Efter spinal transection, en liten bit av sterila gelfoam, indränkt i steril koksaltlösning (0,9%) är försiktigt placeras in i lesionen kaviteten för att främja hemostas. En extra bit av gelfoam placeras sedan över utsatta snurraal sladden. Huden är då stängd med sterilt, rostfria kirurgiska häftklamrar. Ämnen sedan återvände till sina hem burar, placeras på en pappershandduk för att förhindra aspiration av strö och värms med en värmedyna under en period på cirka 12 timmar. Ämnen är också försedda med Hydrogel förpackningar (ClearH2O) och pellets mat på golvet i sina burar under tidig återhämtning. Skadade personer kan få tillgång till mat / vatten i deras hem burar gång återhämtat sig från narkos. Alla skadade personer erhåller två gånger dagligen manuell urinblåsan evakueringar (på ungefär 12 timmars intervall) med en modifiering av den manuella metoden för Crede under hela studien (40 dagar). Skadade möss också är försedda med två gånger dagligen intraperitoneal injektion på 0,9% koksaltlösning i tre dagar (0,5 cc) för att upprätthålla vätskebalansen, och två gånger dagligen injektioner av opiater buprenorfin (0,05 mg / kg) för att styra postoperativ smärta under en period av 5 dagar. Om djur uppvisar tecken of smärta efter de första 5 dagars period, så skulle de få ytterligare buprenorfin (0,05 mg / kg) dagligen tills tecken på smärta (nedsatt rörlighet, böjd gestalt, underlåtenhet att brudgummen, läte när de hanteras) har försvunnit. 2. Längsgående utvärdering av bentätheten med IVIS Lumina XR i samma kohort av spinally-transected möss Början på dag 10 efter SCI och fortsätter i 10 dagars intervall tills dag 40, bedömde vi höger och vänster lårben och tibiae i levande, sövda patienter (transection SCI och oskadade åldersmatchade kontroller). På dagen för scanning fick försökspersonerna överfördes i sitt hem burar från institutionens Vivarium område till det rum där Bromsok IVIS Lumina XR är inrymt. Alla ämnen är sedan bedövas med samma ketamin / xylazin cocktail tidigare har använts i leveransen av SCI. Denna cocktail säkerställer ett tillstånd av anestesi under en period på 1 till 1,5 timmar, tillräckligt för länge scannning förfarande. Utredaren initierar Lumina XR enheten och gör den interna kameran för att nå operativ temperatur (-90 ° C) (~ 10 minuter). När sövda, är föremål (transection eller kontroll) försiktigt placeras på djuret plattform inom Lumina XR. En hög förstoring objektivet sätts in i enheten så att fokus på både lårben och tibia regioner (Synfält 2.4X2.4cm med hög förstoring objektiv). Om motivet är felaktigt placerad utanför synfältet, dörren öppnas och föremålet omplaceras till vänster eller höger bakbenen är centrerad (Se Figur 2a för korrekt placering av bakbenen). När de väl placerad, kan röntgen-funktionen att utföras. Gör ett val från Energimyndigheten listrutan lämplig för djur (Levande ämne, 35 Kv 100uA, filtrerad röntgenstrålning) När djuret är i rätt position, gör det möjligt för röntgen-funktion genom check-märkning X-Ray ikontrollpanelen. Skaffa röntgenbilden. Se till att hela lårbenet och skenbenet är synliga (se figur 2b). Rå bilddata sparas automatiskt till hårddisken. Representant. TIFF-filer sparas också. Musen är därefter återvänt till sina hem bur och får möjlighet att återhämta sig enligt utredare observation. Processen upprepas sedan med nästa musen. Obs: The Living bildbehandlingsprogram visar omvandlas röntgenbilder som standard. För att visa rå röntgenbilder, ta bort markeringen bredvid X-ray absorption i rättelser / Filtreringsverktyg. När X-ray data har korrigerats för absorption kan du utvärdera relativa bentäthet genom att jämföra signalen intensitet mätning ROI. ROI intensitet ökar med vävnad densitet. 3. Bildanalys av IVIS röntgen skannar Öppna programmet genom att dubbelklicka på den levande bild ikonen. Ladda en röntgenbild genom att klicka på <stRong> Bläddra-knappen. I dialogrutan som visas väljer du mappen intresse och klicka på OK. The Living Image webbläsare visar markerade data tillsammans med användar-ID, etikett information och kamera konfigurationsinformation. För att öppna data, gör något av följande: Dubbelklicka på uppgifter raden Högerklicka på uppgifter namnet och välj Load på snabbmenyn väljer du de data raden och klicka på Load, eller dubbelklicka på miniatyren. Bilden och verktygspaletten visas. Öppna uppgifter är markerad i grönt i webbläsaren. Klicka på ROI Verktyg i verktygspaletten. I ROI Verktyg, välj Mätning avkastning på investeringen från den nedrullningsbara listan. För att ladda 3 ROI har används i detta experiment, klicka på torget ikonen och ladda 3 rutor. Med hjälp av en linjal, mäta längden på lårbenet. Justera längden på två av rutorna vara 1 / 8: e av den totala lårbenet längden. Justera bredden på dessa två rutor vara 1/24th den totala lårbenet längd. Med din linjal, mäta 1 / 8: e av avståndet från den proximala änden av lårbenet, och placera den fyrkantiga så att det är centrerade i lårbenet. Placera den andra torget så att den ligger 1/4th av den totala lårbenet längd från den distala änden av lårbenet (Fig. 3). Dessa ROI: s kan användas för att mäta både proximala och distala femur regioner. Med hjälp av linjal, mäta längden av skenbenet. Justera längden på tredje rutan vara 1 / 8: e av den totala tibial längd. Justera bredden till 1 / 30: e av den totala tibial längd. Placera torget så att centreras och 1 / 8: e den totala längden av skenbenet avstånd från den proximala änden av skenbenet (se figur 3). Klicka på ikonen för Mäta (en penna och linjal). ROI intensitet mätningar visas i röntgenbilden och ROI mätningar tabellen visas. Exportera denna tabell to önskad plats som en. csv-fil. Detta gör att du öppna tabellen med hjälp av Excel. Upprepa detta med alla dina sparade bilder. Konsolidera alla dina data till ett Excel-blad. Statistisk signifikans avgjordes via Students t-test med antingen Microsoft Excel eller SigmaPlot 11,0 programvara (Systat Software). 4. Post mortem analys av bentäthet: Efter förvärvet av den slutliga längsgående röntgen skanna inom IVIS Lumina XR, möss därefter djupt sövda med Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). När djup anestesi har uppnåtts, är de möss transcardially perfusion med frusna kall fosfatbuffrad koksaltlösning med heparain (40 mg / liter) på exsanguinate. När exsanguinated, punktskatter både lårben. Var särskilt noga med att ta bort så mycket mjuk vävnad som möjligt, för det har visat sig påverka densitetsmätningar 11. Linda lårben med vatten fuktad kompress och förvara vid-20C tills du är redo att analysera dem. 5. DXA analys med en Hologic QDR 4000 Bone Densitometerutrustning Tina gasväv-blöt lårben och transfer till Bone Densitometerutrustning svit. Kalibrera utrustningen enligt tillverkarens protokollet, se till att BMC och BMD värden ligger inom acceptabla gränser. Placera en mässing kollimator i maskinen. Detta tillåter användaren att begränsa storleken och vinkel på röntgen stråle att fokusera på ett specifikt mål. Sänk ner tinade lårbenet i en petriskål fylld med vatten (kondyler till vänster, med lårbenet parallellt med sängen), och placera den precis till höger om laser. Ange en biografi (en beskrivande titel som inkluderar identifiering av djur information, behandling, etc.) för lårbenet du håller på att skanna. Skriv Skanna från menyval, välj sedan regionA högupplöst. Ange din inläsningsparametrarna: En scanning region 2 x 0,7489 inches, med 0,01 tums radavstånd och 0,00499 tum punkt upplösning. Notera: Övervaka sökningen medan den pågår. Eftersom röntgen stråle raster skannar provet, bevaka att säkerställa att det finns tillräckligt med vatten i kammaren för att helt täcka benet provet. Skriv Analysera under val menyn. Följ anvisningarna för att markera hela lårbenet som en ROI. En rapport sida kommer komma upp med den beräknade BMC (gram) och BMD (GMS / cm 2). Upprepa dessa steg för att analysera de återstående lårben. Konsolidera alla dina data till ett Excel-ark och göra den statistiska analysen (t-test). 6. Representativa resultat: Den relativa bentäthet förlust av en mus skenbenet och lårbenet efter ryggmärgsskada jämfört med naiva möss kan upptäckas med hjälp av ovanstående metod. Det finns en detekterbar signifikant minskning av bentäthet efterbara 10 dagar (12%, p <0,0005), med upp till 15% bentäthet förlust på 40 dagar (p <0,0005, figur 4). Bentäthet förlust i lårbenet observerades vid 40 dagar efter skadan (7% minskning, p <0,05, Figur 5). Dessa resultat ger belägg för användning av icke-invasiva röntgenbilder för longitudinella observation av bentätheten förändras efter ryggmärgsskada. För att kunna jämföra effekten av denna metod för att vad som nu finns, vi analyserade censurerade lårben av dessa möss 40 dagar efter skada med hjälp av DXA avbildning. En representation av utdata kan ses i Figur 6. Vi fann att det fanns en betydande förlust av benmineralinnehåll i SCI möss jämfört med naiva (12% minskning, p <0,05, figur 7). Bentäthet förändrades inte nämnvärt, men har följt en liknande trend (Figur 8). Dessa resultat liknar de som finns i litteraturen, Picard et al observerade en 13,5% minskning (p <0,001) i BMC, men inga signifikanta Sänklätthet i BMD (Picard 2008). Figur 1. Experimental tidslinjen. Figur 2 representant orientering vänster bak-lem:. A) foto och b) x-ray. Figur 3. ROI dimensioner och orientering inom regioner i proximala lårbenet och skenbenet. Figur 4. Bentäthet förlust efter SCI i proximala tibia 10, 20, 30 och 40 dagar efter skada (n = 5) jämfört med åldersmatchade naives (n = 5). Felstaplar representerar SEM, ** p <0,005, *** p <0,0005. <stRong> Figur 5. Bentäthet förlust efter SCI i proximala lårbenet 10, 20, 30 och 40 dagar efter skada (n = 5) jämfört med åldersmatchade naives (n = 5). Felstaplar representerar SEM, * p <0,05. Figur 6. Bentäthet förlust efter SCI i distala femur 10, 20, 30 och 40 dagar efter skada (n = 5) jämfört med åldersmatchade naiva kontroller (n = 5). Felstaplar representerar SEM, * p <0,01 till 0,05, ** p <0,001 till 0,01, *** p <0,0001 till 0,001; **** p <0,0001. Figur 7. Representant bild av DXA uppgifter som visar BMC och BMD utgång. Figur 8. DXA-analys av benmineralinnehåll (gram) i lårben av SCI möss 40 dagar efter skada (n = 5) jämfört med åldersmatchade naives (n = 5).Felstaplar representerar SEM, * p <0,05. Figur 9. DXA-analys av bentäthet (mg / cm 2) i lårben av SCI möss 40 dagar efter skada (n = 5) jämfört med åldersmatchade naives (n = 5). Felstaplar representerar SEM, ingen signifikant skillnad.

Discussion

Denna studie presenterar en ny, icke-invasiv metod för att bedöma tätheten förändringar inom enskilda ben (tibiae och lårben) i längdriktningen, inom ett och samma kohort av möss, med hjälp av klave IVIS Lumina XR Imaging System. SCI fram en minskning i bentäthet i både lårben och tibiae när studeras inom ett och samma kohort av spinally-transected möss under en 40 dagars test period jämfört med åldersmatchade, oskadda, kontroll möss. Våra resultat i lårbenet bekräftades, obduktioner, med hjälp av DXA, vilket tyder på att tillämpningen av Bromsok Instrument IVIS Lumina XR kan fungera som en känslig mätverktyg för att bedöma de långsiktiga och progressiva effekter av SCI på benförlust .

En möjlig fördel för utredare med detta system är förmågan att longitudinellt följa utvecklingen av sjukliga förändringar i bakbenen ben av djur efter SCI. Förmåga att bedöma en enskild kohort över långa tidsperioder ger stRong fördelar med att utredaren i termer av: 1) kostnader i samband med djur-köp och omsorg. Istället för en studie som kräver ett stort antal djur som måste offras vid specifika tidpunkter för att utvärdera tidsberoende förändringar kan dessa patologiska resultat följas inom samma kohort under samma tidsperiod, 2) variabilitet: förutom jämförelse med kontroll kohorter, kan resultaten som genereras inom samma kohort av skadade ämnen ska bedömas och jämföras mellan tidpunkter för samma djur i hela omfattningen av studien, en gång, vilket minskar både inom djur variation liksom behov av större kohorter av försökspersoner.

Medan Bromsok IVIS Lumina XR gav oss viktiga longitudinella information om utvecklingen av SCI-inducerad osteoporos, det finns begränsningar som bör övervägas: 1) medan denna plattform har gett oss möjlighet att skapa högupplöst röntgen daten i bakbenen benen av möss efter SCI, kan dess användbarhet begränsas till små gnagare som möss. Den maximala ämnet höjd tillåtet inom Lumina XR är 2,8 cm. Allt ovanför den höjden inte kan lyckas avbildas med röntgen del av Lumina XR. I våra händer har detta hindras vår förmåga att studera råttor i 200-250 grams vikt. Även om det kan vara möjligt att bilden råttor under denna vikt område eller andra gnagare som hamstrar eller gerbiler, kommer detta att kräva ytterligare tester av PI. 2) Gemensam läggning. Det är viktigt att utredarens noggrant ordna lemmar i en lätt reproducerbart inriktning som kommer att möjliggöra en framgångsrik jämförelse mellan avbildning sessioner. Standardisering av lem placering gör det möjligt för forskare att generera och tillämpa standardiserade ROI är som kan sparas och användas i både ämnen och tid.

Sammantaget tror vi att IVIS Lumina XR ger en utmärkt plattform som till modellutvecklingen av SCI-beroende osteoporos hos möss. Möjligheten att studera benförlust longitudinellt inom samma musen kohort ger oss möjlighet att: 1) bättre förstå den temporala karaktären av benförlust och demineralization efter SCI, 2) avgöra om dessa förändringar stabiliseras över tid, 3) utforska, med tillgången på både transgena och null linjer mus, förmågan att studera de molekylära mekanismerna bakom dessa patologiska förändringar i ett reduktionistiskt sätt, och 4) kanske den viktigaste fördelen, att börja testa nya insatser som är utformade för att antingen förhindra uppkomsten av benskörhet i ett tidigt skede för skada, eller, för att vända sådana förändringar när osteoporos har redan utvecklat. Slutligen, de Lumina XR förutom att ge utmärkt röntgen potential, kan också användas för att studera både självlysande och fluorescerande signaler i levande djur. Man kan lätt föreställa sig att införliva andra villkor som erbjuds inom detta system att titta på en multitude av faktorer som avgör ben dynamik mekaniskt efter SCI eller någon annan sjukdom process som resulterar i benskörhet.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Beuthanasia	Butler Schein Animal Health	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Schein Animal Health	023061
Xylazine	Butler Schein Animal Health	037849
Bupivicaine	Butler Schein Animal Health	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production