Bilaminar Co-kultur Primary Rat kortikale nevroner og gliaceller

Summary

Her tilbyr vi en protokoll for dyrking rotte kortikale nevroner i nærvær av en glial mater lag. Den dyrkede nerveceller etablere polaritet og skape synapser, og kan skilles fra gliaceller for bruk i ulike programmer, som elektrofysiologi, kalsium bildebehandling, celle overlevelse analyser, immunocytochemistry, og RNA / DNA / protein isolasjon.

Abstract

Denne videoen vil guide deg gjennom prosessen med dyrking rotte kortikale nevroner i nærvær av en glial mater lag, et system kjent som en bilaminar eller co-kulturen modell. Dette systemet er egnet for en rekke eksperimentelle behov som krever enten et glass eller plast vekst substrat, og kan også brukes til kultur for andre typer nerveceller.

Rat kortikale nevroner hentet fra slutten av fosterstadiet (E17) er belagt på glass Dekkglass eller vev kultur retter overfor en mater lag av gliaceller vokst på oppvasken eller plast Dekkglass (kjent som Thermanox), henholdsvis. Valget mellom de to konfigurasjoner avhenger av den aktuelle eksperimentelle teknikken som brukes, noe som kan kreve, eller ikke, er at nervecellene vokst på glass (f.eks kalsium bildebehandling versus Western blot). Den glial mater lag, en astroglia-beriket sekundære kultur blandet gliaceller, er separat forberedt fra cortices av nyfødte rotteunger (P2-4) før neuronaldisseksjon.

En stor fordel med denne kulturen system i forhold til en kultur av nerveceller er bare støtte av neuronal vekst, overlevelse, og differensiering leveres av trofiske faktorer skilles fra glial mater laget, som mer nøyaktig ligner hjernen miljøet in vivo. Videre kan co-kulturen brukes til å studere neuronal-glial interaksjoner ^1.

Samtidig er gliaceller forurensning i nevronale lag hindres av ulike virkemidler (low density kultur, tillegg av mitotisk hemmere, mangel på serum og bruk av optimalisert kultur medium) fører til en nesten ren nevrale lag, kan sammenlignes med andre etablerte metoder ^{1 -3.} Nevroner kan lett skilles fra glial lag når som helst under kultur og brukes til ulike eksperimentelle applikasjoner som spenner fra ⁴ elektrofysiologi, cellulær og molekylær biologi ^5-8, biokjemi ^5, bildebehandling og microscopy ^4,6,7,9,10. Den primære nevroner utvide axoner og dendritter å danne funksjonelle synapser ^11, en ​​prosess som ikke er observert i neuronal cellelinjer, selv om noen cellelinjer gjør utvide prosesser.

En detaljert protokoll av dyrkning rotte hippocampus nevroner bruker denne co-kulturen system har blitt beskrevet tidligere ^4,12,13. Her har vi detalj en modifisert protokoll egnet for kortikale nevroner. Som omtrent 20×10 ⁶ celler er gjenvunnet fra hver rotte embryo, er denne metoden spesielt nyttig for eksperimenter som krever et stort antall nevroner (men ikke bekymret for en svært homogen neuronal befolkningen). Utarbeidelse av nevroner og gliaceller må planlegges i en tid-spesifikk måte. Vi vil gi trinn-for-steg protokoll for dyrking rotte kortikale nevroner samt dyrking gliaceller å støtte nervecellene.

Protocol

1. Gliaceller Dissection (~ 2 uker før plating nevroner) Å forberede seg til disseksjon sted sterile verktøy i 70% etanol, tilsett 4 mL kaldt disseksjon medium til 60 mm retter (ett fat per hjernen), og plassere 2,5% trypsin og DNase på is for å tine (se detaljer om kirurgisk verktøy i tabell VI ). Bruk stor saks til å halshogge 2-4 dager gamle valper og sted hoder i en 100 mm steril parabolen. Bruk medium saks å lage en midtlinje skjære gjennom huden og trekke tilbake huden å av…

Discussion

Denne protokollen gir en metode for dyrking rotte primære kortikale nevroner i nærvær av gliaceller celler, samtidig som nervecellene skal være lett isolert for eksperimentell analyse. Den gliaceller støtte utviklingen av en sunn neuronal fenotype, mens også modulerende nevrale responser til eksperimentelle behandlinger i en fysiologisk relevant måte. I tillegg, ved passaging den primære gliaceller før dyrking med nevroner denne cellen befolkning blir selektivt anriket i astrocytes, og dermed hindre inflammator…

Materials

Reagent	Concentration
Glucose	16 mM
Sucrose	22 mM
NaCl	135 mM
KCl	5 mM
Na2HPO4	1 mM
KH2PO4	0.22 mM
HEPES	10 mM
pH	7.4
Osmolarity	310±10 mOsm

Table 1. Dissection Medium.

Reagent	Concentration
DMEM	90%
FBS	10%
Gentamicin	50 μg/mL

Tabe 2. Glia Plating Medium.

Reagent	Concentration
DMEM	90%
Horse Serum	10%

Table 3. Neuron Plating Medium.

Reagent	Concentration
DMEM	98%
N2 Supplement	1%
1M HEPES	1%
Ovalbumin	50 mg/100mL

Table 4. N2 Medium.

Reagent	Concentration
Boric Acid	50 mM
Sodium Borate	12.5 mM

Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).

Reagent	Company	Catalogue number
High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated	Hyclone	26400-044
Horse Serum, Heat-inactivated	Hyclone	H1138
Gentamicin (50mg/mL)	Invitrogen	15750-060
N2 Supplement (100x)	Invitrogen	17502-048
HEPES buffer solution	Invitrogen	15630-080
Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin)	Sigma-Aldrich	A2512
2.5% Trypsin	Invitrogen	15090-046
0.5% Trypsin-EDTA (10X)	Invitrogen	15400-054
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Sigma-Aldrich	D-5025
Paraplast	Fisher	12-646-106
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1274
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride	Sigma-Aldrich	C6645
Stereomicroscope	Leica	Leica ZOOM 2000
Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm	Carolina	633031
Thermanox sheets	Grace BioLabs	HS4550
Large forceps	Biomedical Research Instruments	70-4000
Fine-tipped No.5 forceps	Fine Science Tools	91150-20
Pattern No.1 forceps	Biomedical Research	10-1400
	Instruments
Scissors, straight, sharp-blunt	Biomedical Research Instruments	28-1435
Micro Dissecting scissors	Biomedical Research Instruments	11-2070
Micro Dissecting Curved scissors	Biomedical Research Instruments	11-1395