Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia
Summary
Aqui nós fornecemos um protocolo para a cultura de neurônios corticais de ratos na presença de uma camada de alimentação glial. Os neurônios cultivados estabelecer polaridade e criar sinapses, e pode ser separada da glia para uso em diversas aplicações, tais como eletrofisiologia, imageamento de cálcio, ensaios de sobrevivência celular, imunocitoquímica e RNA / DNA / isolamento de proteínas.
Abstract
Este vídeo irá guiá-lo através do processo de neurônios corticais de ratos cultura na presença de uma camada glial alimentador, um sistema conhecido como um bilaminar ou co-cultura modelo. Este sistema é adequado para uma variedade de necessidades experimental exigindo um vidro de substrato de crescimento ou de plástico e também pode ser usado para a cultura de outros tipos de neurônios.
Neurônios de rato cortical obtidos a partir da fase tardia embrionário (E17) são semeadas em lamínulas ou pratos de cultura de tecidos de frente para uma camada de alimentador de glia cultivadas em pratos de plástico ou lamelas (conhecido como Thermanox), respectivamente. A escolha entre as duas configurações depende da técnica específica experimental usado, o que pode exigir, ou não, que os neurônios são cultivados em vidro (por exemplo, imagens de cálcio em relação Western blot). A camada glial alimentador, uma cultura astroglia enriquecido secundária de glia mista, é separado preparado a partir do córtex de filhotes de ratos recém-nascidos (P2-4) antes da neuronaldissecção.
Uma grande vantagem deste sistema de cultura em relação a uma cultura de neurônios é apenas o suporte de crescimento neuronal, sobrevivência e diferenciação proporcionada por factores tróficos secretados a partir da camada alimentador glial, que se assemelha mais precisão o ambiente do cérebro in vivo. Além disso, a co-cultura pode ser usado para estudar as interações neuronal glial-1.
Ao mesmo tempo, a contaminação glia na camada neuronal é impedido por diferentes meios (cultura de baixa densidade, além dos inibidores da mitose, a falta de soro e uso de meio de cultura otimizado), levando a uma camada praticamente pura neuronal, comparável a outros métodos estabelecidos um -3. Neurônios podem ser facilmente separados da camada glial a qualquer momento durante a cultura e utilizadas para diferentes aplicações experimentais que vão de eletrofisiologia 4, biologia celular e molecular 5-8, bioquímica 5, de imagem e microfoneroscopy 4,6,7,9,10. Os neurônios primários estender axônios e dendritos para formar sinapses funcionais 11, um processo que não é observado em linhagens de células neuronais, embora algumas linhagens celulares se estendem processos.
Um protocolo detalhado de neurônios do hipocampo de ratos cultura usando este sistema de co-cultura tem sido descrito anteriormente 4,12,13. Aqui detalhamos um protocolo modificado adequado para neurônios corticais. Como cerca de 20×10 6 células são recuperados de cada embrião de rato, este método é particularmente útil para experimentos que requerem um grande número de neurônios (mas não preocupado com uma população altamente homogênea neuronal). A preparação de neurônios e células gliais precisa ser planejada de maneira tempo específico. Vamos fornecer o protocolo passo a passo para os neurônios corticais de ratos cultura, bem como a cultura de células gliais para apoiar os neurônios.
Protocol
Discussion
Este protocolo fornece um método para cultura primária de neurônios corticais de ratos na presença de células da glia, permitindo que os neurônios para ser facilmente isolado para análise experimental. O apoio ao desenvolvimento glia de um fenótipo neuronal saudáveis, ao mesmo tempo, modulando respostas neuronal para tratamentos experimentais de forma fisiologicamente relevantes. Além disso, por passaging da glia primária antes de cultura com os neurônios desta população de células torna-se seletivamente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem membros de laboratório anteriores que contribuíram para o refinamento deste protocolo e os NIH para o apoio ao longo dos anos (e DA19808 DA15014 a OM). Anna Abt 1 é um companheiro da "Formação Interdisciplinar de Pesquisa e translacional em neuroAIDS" (T32-MH078795); assim, este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais da Saúde sob Ruth Kirschstein National Research Service Award L. 5T32MH079785.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical Research Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical Research |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Research Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical Research Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Research Instruments |
11-1395 |
References
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