Summary

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Published: September 02, 2011
doi:

Summary

Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel karakterizasyonu<em> In vitro</em> Modeli. Bu yaklaşım uzun vadeli ko-kültür için uygun herhangi bir mikrop ile kullanılabilir.

Abstract

2; Tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi), tekrarlayan ve kronik solunum mukoza 1 enfeksiyonlara yol açabilir insan adapte Gram-negatif bakteriler . Bu organizmalar solunum dokularda ve iç hayatta hangi mekanizmaları, bakteri ve insan hücreleri başarılı bir şekilde uzun vadeli işbirliği kültürü yapılabilir hangi modelin incelenmesi. Biz hava-sıvı arayüzü yükseltilmiş birincil insan solunum yolu epitel dokuların kullanımı, EpiAirway modeli (Mattek, Ashland, MA). Bu sıkı kavşaklar, siliyalı ve nonciliated hücreleri, müsin üreten ve enfeksiyona karşı sitokin üretme yeteneğini muhafaza goblet hücreleri içeren olmayan ölümsüzleştirdi, iyi diferansiye, 3-boyutlu dokular.

Bu biyolojik olarak insan üst solunum yolu in vitro model ilgili bir dizi şekillerde kullanılabilir; zamanla bu yöntem genel hedefi, NTHi ve Asitli EpiAirway dokuların uzun vadeli işbirliği kültürü hücre ilişkili ve içselleştirilmiş bakteriler gerçekleştirmek için . Yanı sıra, enfekte ko-kültür müsin üretimi ve sitokin profili tespit edilebilir. Bu yaklaşım, pek çok mevcut protokoller mevcut yöntemleri geliştirir uzun süre 3 üzerinde bakteriyel enfeksiyonlar destekleme yeteneğine sahip değildir, insan hücrelerinin batık tek tabaka veya transwell kültürleri, kullanın . Örneğin, eğer bir organizmanın üstteki medya çoğaltmak, bu deney tutuklamak, sitotoksisite ve ev sahibi hücrelerin kaybı kabul edilemez düzeyde neden olabilir. EpiAirway modeli uzun vadeli konak-patojen etkileşimi karakterizasyonu sağlar. EpiAirway için kaynak ölümsüzleştirilen çizgisinden daha çok bir normal insan trakea-bronş hücreleri beri Ayrıca, her gerçek insan üst solunum yolu doku yapısı ve fonksiyonu 4 hem de mükemmel bir temsil,.

Bu yöntem için, EpiAirway dokular teslimattan 2 gün önce anti-mikrobiyal ve anti-mantar bileşiklerin sütten ve tüm işlemler antibiyotik koşullar altında yapılmaktadır. Bu her iki bakteri ve birincil insan dokuları aynı Biyogüvenlik kabini olduğundan, özel durumlar gerektirmektedir ve uzun süre ko-kültür vardır.

Protocol

1. Biyogüvenlik kabini EpiAirway dokular için hazırlanması Geri ve eldiven bağlı saç, özel bir laboratuvar önlüğü giymek, laminer akış başlar. 5 dakika sonra, kabine (Pipet, ipuçları, santrifüj tüpleri, vb) herhangi bir alet taşımak bir yana, sprey,% 70 etanol ve temiz bir kağıt havlu ile silin ile biyogüvenlik kabini iç ve kanat. % 70 etanol ile tekrar temizlenir iç Sprey ve kurumaya bırakın. Temiz tarafında araçları hareket ettirin ve etanol prosedürü tekrarlayın. …

Discussion

Bu yöntem, hava-sıvı arayüzü birincil insan solunum dokuların biyolojik ilgili bir arka planda uzun vadeli konak-patojen etkileşimleri soruşturma sağlar. Burada bulaşmasını organizma olarak NTHi kullanılan, ancak herhangi bir bakterinin zamanla kabul edilemez sitotoksisite tanıtmak gelmez bu yöntem ile etkileşimi sayılabilir olabilir. EpiAirway model aynı zamanda, virüsler, ilaçlar, ya da kimyasalların bu etkiyi insan üst solunum yolu 5 çalışma için kullanılan, 6, 7, 8 . …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yararlı tartışmalar için teşekkür Patrick Hayden (Mattek) ve Robert Smith ve EM becerileri Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi Libby Perry. Bu çalışmada DAD NIDCD hibe DC010187 tarafından finanse edildi

Materials

Name of reagent Company Catalogue# Comments
Saponin Calbiochem 558255-25GM 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium Lonza 17-513Q  
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium Lonza 17-515Q  
EpiAirway antibiotic-free tissues MatTek AIR-100-ABF  
EpiAirway antibiotic-free maintenance media MatTek AIR-100-MM-ABF Supplied with kit
10X phosphate-buffered saline solution EMD 6506 Dilute to 1X before use
Gelatin JT Baker 2124-01 Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave
Difco GC Medium Base (chocolate agar) VWR 90002-016 Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C
BBL Hemoglobin (chocolate agar) VWR 90000-662 Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above
BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) VWR 90000-414 Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates
Dissecting forceps, fine tip, curved VWR 82027-406  
Self-sealing sterilization pouches VWR 89140-802  
Gentamicin sulfate, 10 mg/ml Lonza 17-519Z Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill

References

  1. Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
  2. Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
  3. Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
  4. Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
  5. Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
  6. Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
  7. Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
  8. Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
  9. Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
  10. Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).

Play Video

Cite This Article
Ren, D., Daines, D. A. Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (55), e3261, doi:10.3791/3261 (2011).

View Video