私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。
日付に、適切なヒト心筋細胞源の欠如は、セルベースの移植によって、または心臓組織工学,1 – 3で、人間の心筋を再生させるの大きな後退要因となっている。心筋細胞は生後間もなく終末分化と増殖する能力を失うとなる。このような骨髄や臍帯血などの他のソースから派生した幹細胞/前駆細胞は、1-3心臓に移植後の収縮、心臓の筋肉細胞を生じさせることができるという証拠はない。損傷した心臓の筋肉を再生または修復する必要がある内因性または1-3細胞の配信を介してのいずれか、成体幹細胞治療によって満たされていない。遺伝的に安定したヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)を必要とする系統に制限されているヒト体細胞の大規模な供給のin vitroでの導出のための多能貯水池をproffering、無制限の拡張機能と無制限の可塑性を持っている修復と再生4,5の。心血管疾患の有病率ドナー臓器の全世界と深刻な不足のために、別のアプローチとして、ヒトES細胞ベースの治療法の開発に強い関心があります。しかし、所望の表現型に効率的かつ予測可能な多能性ヒトES細胞の広い分化能をチャネルする方法を発達研究と臨床の翻訳の両方にとって大きな課題となっています。従来のアプローチは、しばしば表現型の異質性と不安定性、それゆえ、腫瘍形成6-8のハイリスク(で回路図を参照して続いている非効率的で制御不能系統コミットメントの結果として、自発的な胚層の差別化による多能性幹細胞の多系統傾きに依存しています図1A)。さらに、定義されていない外国人/動物の生物学的なサプリメントおよび/または一般的に隔離、拡張、およびヒトES細胞の分化のために使用されているフィーダは、このような細胞specialiを直接使用することがあります9月11日 、問題のある患者でZED移植。これらの障害を克服するために、我々は臨床的に適切なヒトES細胞の de novo導出するためのプラットフォームとして、ヒトES細胞の胚盤葉上層のpluripotenceを維持するために必要かつ十分な定義培養系の要素を解決し、効果的に臨床的に意義のある系統に向かって一様にそのようなヒトES細胞を演出している小分子12( 図1Bの回路図を参照)によって。小分子や増殖因子の様々なスクリーニングした後、我々はそのような定義された条件は、レンダリングされたニコチンアミド(NAM)、さらに高効率( 図2と人間の拍動心筋細胞を生成cardioblastsに進んだ多能性ヒトES細胞から直接cardiomesodermの仕様を誘導するのに十分を発見)。我々は十分に制御された効率的な導出を可能にする、介在する多系統胚様体ステージのない多能性ヒトES細胞から直接cardioblastsの誘導のための条件を定義細胞ベースの治療のための発達段階のスペクトルにわたってヒト心筋細胞の大量供給。
発達研究と臨床の翻訳の両方の主要な課題の一つは、効率的かつ予測可能所望の表現型に多能性ヒト幹細胞の広範な分化能をチャネルする方法をされています。このような細胞は、自発的にヒトES細胞由来の多系統凝集体(胚様体)、細胞の唯一のごく一部(<2%)で、多系統の集約の段階を経由して、すべての胚葉の細胞に試験管内で自発的に区別することができますが、心筋細胞13から15( 図1A)に分化する。以下の免疫選択、心筋細胞の濃縮された集団は、動物モデル13の中心に注入後、機械的および電子的に損傷した心筋の機能を救出するために生物学的ペースメーカーとして機能することができた。齧歯類梗塞モデルでは、移植されたヒトES細胞由来心筋子孫は生き残り、12週間まで成熟することができた、と部分的にremuscular傷ついた心をIZEと収縮機能14,15を改善する。しかし、移植後の多能性細胞と腫瘍形成のリスクが高いの多系統分化を通じて、人間の心臓、コミットされた細胞の生成の非効率性は、さらなる臨床の翻訳を妨げている。心臓の表現型への排他的かつ予測多能性ヒトES細胞の広い分化能を流すための戦略を開発することを活用心臓場でヒトES細胞の生物学の力に不可欠です。一様に特定の系統のヒト多能性幹細胞の変換を達成するために、我々は特定の臨床的に意義のある系統に独占的に多能性ヒトES細胞の十分に制御された効率的な誘導のための条件を識別するために、未分化ヒトES細胞の増殖を保証することのできる定義された培養系を採用小分子のシンプルなプロビジョニング( 図1Bの )で。我々は、ニコチンアミドは、pから直接心臓系統コミットメントを誘導することを発見さらなる高効率( 図2)で拍動心筋細胞に進んで定義された文化の下でluripotentヒトES細胞。 Nkx2.5は、人間の先天性心疾患(CHD)、最も一般的な人間の先天性欠損症16に関連している遺伝子の正常な心臓の開発と変異のために不可欠な進化的に保存されたホメオボックス転写因子です。 Nkx2.5の発現は、これまで検討すべての脊椎動物における心臓前駆細胞の最も早いマーカーであり、適切な心臓の中隔および形成/電気伝導系16の成熟に必須である。脊椎動物では、初期のNkx2.5発現の発症とパターンはほぼ初期胚発生における心臓仕様のタイミングと面積と一致し、Nkx2.5遺伝子は、心臓16の開発によって表現され続けている。私たちのhESCのモデルでは、NAMは心臓特異transcriの発現を促進することにより、多能性ヒトES細胞から直接心臓の誘導を引き起こすように見えたヒト胚心臓発生における多能性胚盤葉上層からcardiomesodermの仕様をエミュレートする可能性があるプロセスでption因子Nkx2.5。今後の研究は再生治療のために臨床的に意義のある系統を派生させる場合にhESCの多能性の運命の小分子を介した直接制御と変調のための道を開く可能性がある、代替案として、人間の心の発達に遺伝的およびエピジェネティックな制御分子を明らかにする。 NAMの治療がなければ、<2%のヒトESは、心筋細胞12-15破っに自発的な分化を受けることになる。 NAMの治療では、我々は、ヒト胚心臓の開発12をエミュレートする可能性があるプロセスで定義する文化の下で保持ヒトES細胞から> 95%胚心臓の前駆体と> 50%の鼓動の心筋細胞を生成することができた。最近、知られている心臓の運命を決定する遺伝子は、<0.5%17、18の低効率と出生後の拍動心筋細胞にマウスの線維芽細胞の分化形質転換するために使用されている</>のSup。しかし、再プログラム体細胞は、歴史的に異常な遺伝子発現および障害の治療ユーティリティ19から21までの加速老化と関連している。最後に、我々はここで確立されたプロトコルは、内部細胞塊(ICM)または4,5人間の胚盤胞の胚盤葉上層に由来する多能性ヒトES細胞に限定される以前の桑実胚に由来する動物起源のESCは、ES細胞を含む他の多能性細胞、に適用されない場合があります(8細胞)ステージの胚22、および人工的に再プログラム細胞23。
The authors have nothing to disclose.
XHPは、国立老化研究所(NIHK01AG024496)と母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所(NIHR21HD056530)から健康(NIH)助成金の国立研究所によってサポートされています。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |