아이스 캡 방식은 하나가 각 묘목의 96 – 웰 플레이트 및 비 destructively 수확 루트 조직에 식물을 성장 할 수 있습니다. 이 루트 조직에서 추출한 DNA는 genotyping 반응에 사용될 수 있습니다. 우리는 얼음 모자가 잘 작동하는지 발견<em> Arabidopsis thaliana</em>, 토마토, 쌀 모종.
그것은 식물이 다수의 genotyping을 필요로 프로젝트를 개발하기 위해 식물 과학자에 대한 일반지고 있습니다. 모든 genotyping 프로젝트의 첫 번째 단계는 각각의 공장에서 조직 샘플을 수집하는 것입니다. 이 작업에 대한 전통적인 접근 방식은 샘플 식물 하나에서 – – 시간입니다. 개인의 유전자형 수백 또는 수천 한 소망 그러나, genotyping 파이프라인에 상당한 병목 현상이 전략 결과를 사용하는 경우. 우리가 여기서 설명하는 아이스 캡 방식은 과학자 한사람 하루 1,2에서 수천 모종의 조직을 수집할 수 있도록 허락해하여이 도전하는 높은 처리량 솔루션을 제공합니다. 처리량이 수준은 조직이 아니라 하나에서 – – 시간보다, 식물의 96시 – 시간을 수확있다는 사실에 의해 가능하게됩니다.
아이스 캡 방법은 묘목의 성장, 조직 수확 및 DNA 추출을 수행하기위한 통합 플랫폼을 제공합니다. 얼음 모자의 기초는 seedli의 성장입니다96 – 웰 플레이트의 스택 쌍의에 ngs. 상단 접시의 우물 개별 모종은 발아되는 한천 성장 미디어의 플러그가 포함되어 있습니다. 뿌리는 한천 매체를 통해 구멍을 통해 상부 판을 종료하고, 낮은 플레이트가 포함된 물에 통과 아래로 성장합니다. 상단 플레이트에있는 묘목은 실온에서 유지하면서 DNA 추출, 뿌리 조직을 포함하는 낮은 접시에 물이 조직을 수확하는 것은 급속 냉동입니다. 상부 판은 다음 얼음과 96 가능한 모종 한 판에 얼어 붙 어서 96 루트 조직 샘플 한 접시를 항복, 멀리 낮은 접시에서 벗겨 있습니다. 그것은 루트 조직을 캡처하는 얼음을 사용하기 때문에이 기술은 "아이스 모자"라는 것입니다. 묘목을 포함한 96 – 웰 플레이트 다음 호일에 싸여과 낮은 온도로 전송하실 수 있습니다. 이 과정은 모종의 추가 성장을 정직 시키실지만, 그들의 생존에 영향을주지 않습니다. 유전자형 분석이 완료되면 원하는 유전자형과 모종은 96 잘 P에서 전송할 수 있습니다자세한 전파를 위해 토양에 늦었어요. Arabidopsis thaliana 우리는, 토마토, 그리고 쌀 모종을 사용하여 아이스 캡 방식의 유틸리티를 증명하고있다. 우리는 방법도 96 – 웰 플레이트의 우물에 들어갈만큼 작은 씨앗과 식물의 다른 수종에 적용되어야한다고 기대합니다.
여기에 제시 아이스 캡 방법은 하루에 각 식물의 수백, 또는 수천의 조직 샘플을 수집하고 효율적으로 genotyping 반응에 사용하기 위해 이러한 샘플에서 게놈 DNA를 추출 한 과학자 수 있습니다. 개별 과학자 시간의 짧은 기간에 모종의 수천을 유전자형 수있는 능력을 제공함으로써, 아이스 캡 방식은 다르게 수행하는 실용적 않을 유전자 실험의 숫자를 촉진시킬 잠재력이있다. 몇 가지 예제가 아래에 제공됩니다.
iTILLING 뒤에 아이디어는 전통적인 TILLING 프로젝트 만든 내구성 돌연변이 인구 대비 서 임시 돌연변이 인구를 생산하는 것입니다. iTILLING 들어, bulked M2 인구의 종자가 50-100 얼음층 블록에 sown하고 있으며, DNA는 아이스 캡 방법을 사용하여 추출됩니다. Arabidopsis 모종은 다음 4에 배치됩니다 ° C 돌연변이 검사는 아이스 캡 DNA를 사용하여 수행하는 동안 preps. 토마토 모종은 12 ° C.에 저장됩니다. 모종 운반 원하는 돌연변이가 확인되고 나면, 그들은 아이스 캡 접시에서 회복하고 흙으로 전송됩니다. iTILLING는 화면 전체 연구 커뮤니티에 대한 지속적인 돌연변이 인구를 제공하기위한 것이 아닙니다. 대신, iTILLING는 전략을 제공하는과학자 한사람 효율적으로, 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 신속하게 유전자의 소수의 돌연변이에 대한 사용자 지정 돌연변이 인구를 스크린 수 있습니다.
우리는 Arabidopsis, 토마토, 그리고 쌀을 재배하고 genotyping을위한 효과적인 방법으로 얼음 모자를 발견했습니다. 우리는 식물의 다른 종류도 아이스 모자 의무가되어야한다는 기대합니다. 아이스 캡에 의해 수용 수있는 수종의 다양한 한 제한은 종자의 크기입니다. 96 – 웰 플레이트의 우물에 들어갈만큼 작은 씨앗과 식물만이 현재 구성에서 아이스 모자와 호환됩니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 과학 재단 (부여 번호 MCB – 0447750)에서 부여에 의해 투자되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |