Klumpformet Assay til måling af TGF-β-induceret Invasion
Summary
En analyse til kvantitativ måling Omdannelse vækstfaktor (TGF)-β-induceret invasion i 3-dimensionelle kollagen geler er beskrevet. Denne analyse tager fordel af MCF10A serie af cellelinier, der repræsenterer forskellige stadier af brystkræft udvikling. Denne metode kan vedtages skal bruges sammen med andre cellelinjer og kan bruges til at undersøge andre potentielle aktivatorer eller inhibitorer af invasion.
Abstract
TGF-β har modsatrettede roller i brystkræft progression ved at fungere som en tumor suppressor i den indledende fase, men stimulerende invasion og metastasering på et senere tidspunkt 1,2. Desuden er TGF-β ofte overudtrykt i brystkræft og dens udtryk korrelerer med dårlig prognose og metastasering 3,4. De mekanismer, som TGF-β fremkalder invasion er ikke godt forstået.
TGF-β fremkalder dets celle-respons via TGF-β type II (TβRII) og type I (TβRI) receptorer. Ved TGF-β-induceret heteromeric kompleks dannelse, phosphorylates TβRII de TβRI. Den aktiverede TβRI indleder sit intracellulære kanoniske signalvejen fra phosphorylerende receptor Smads (R-Smads), dvs Smad2 og Smad3. Disse aktiveres R-Smads formular heteromeric komplekser med Smad4, som ophobes i kernen og regulere transskription af målet gener 5. Ud over de tidligere described Smad vej, receptor aktivering resulterer i aktivering af en række andre ikke-Smad signalveje, for eksempel mitogen aktiveret protein kinase (MAPK) veje 6.
For at undersøge betydningen af TGF-β i forskellige stadier af brystkræft, har vi gjort brug af MCF10A cellesystem. Dette system består af spontant udødeliggjort MCF10A1 (M1) bryst epitelceller 7, forvandlede H-RAS M1-derivat MCF10AneoT (M2), der producerer præmaligne læsioner i mus 8, og M2-afledte MCF10CA1a (M4), som blev etableret fra M2 implanteret og former høj kvalitet carcinomer med evnen til at metastaserer til lungerne 9. Denne MCF10A serie giver mulighed for at studere svarene af celler med forskellige kvaliteter af malignitet, der ikke er forudindtaget af en forskellig genetisk baggrund.
Til analyse af TGF-β-induceret invasion, genererede vi homotypic MCF10A klumpformet cellekulturer embedded i en 3D Kollagenmatrix'en in vitro (figur 1). Sådanne modeller ligner humane tumorer in vivo ved at etablere en gradient af ilt og næringsstoffer, hvilket resulterer i aktiv og invasive celler på ydersiden og passiv eller endda nekrotisk celler i den indvendige side af klumpformet 10. Klumpformet baserede analyser har også vist sig at bedre at rekapitulere resistens over for lægemidler end éncellelag kulturer 11. Denne MCF10 3D-model system gav os mulighed for at undersøge virkningen af TGF-β signalering på invasive egenskaber bryst celler i forskellige stadier af malignitet.
Protocol
Discussion
Vi har etableret en klumpformet model, hvor MCF10A1 celler og dens maligne derivater invaderer ind i en Kollagenmatrix'en i en TGF-β-afhængig måde. For det første er spheroids dannet i 96-brønde rund bund suspension plader i overværelse af methylcellulose. Selvfølgelig kan også U-formet poly-HEMA plader anvendes til dette formål. Methylcellulose er absolut påkrævet i dette trin, da celler vil dø i mangel af methylcellulose. TGF-β er tilsat direkte til kollagen-methocel blanding, da vi fandt, at celler r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, USA) til reagenser og Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Intitute, Detroit, USA) for cellelinjer.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |
References
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer–a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn’t flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
