En introduktion till parasitsteklar av<em> Drosophila</em> Och Antiparasite immunsvar
Summary
Parasitoid (parasitiska) getingar utgör en stor klass av naturliga fiender många insekter, inklusive<em> Drosophila melanogaster</em>. Vi kommer att införa tekniker för att sprida dessa parasiter i<em> Drosophila</em> SPP. och visa hur man kan analysera deras effekter på immun vävnader<em> Drosophila</em> Larver.
Abstract
Mest kända parasitoid geting arter angripa larvala eller puppa stadier av Drosophila. Medan Trichopria drosophilae infektera puppa stegen i värden (Fig. 1A-C), honor av släktet Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) och Ganaspis (Fig. 1E) angriper larvstadierna. Vi använder dessa parasiter för att studera den molekylära grunden för en biologisk kapprustning. Parasitsteklar har en enorm värde som biokontrollmedel. De flesta av dem bär virulens och andra faktorer som modifierar host fysiologi och immunitet. Analys av Drosophila getingar ger insikter i hur arter-specifika interaktioner forma genetiska strukturer av naturliga gemenskaperna. Dessa studier fungerar också som en modell för att förstå de värdens immunsystem fysiologi och hur samordnade immunreaktioner bemöts med denna klass av parasiter.
Den larver / puppa ytterhud tjänar som den första raden i defense. Getingen gadd är en skarp nål-liknande struktur som effektivt avger ägg in i värden hemocoel. Oviponering följs av en sårläkande reaktionen vid hinnan (fig. 1C, pilhuvuden). Vissa getingar kan sätta in två eller fler ägg i samma värd, även om utvecklingen av endast ett ägg lyckas. Övertaliga ägg eller utveckla larver elimineras genom en process som ännu inte är klarlagd. Dessa getingar därför kallas solitära parasitoider.
Beroende på fluga stammen och arten geting har WASP ägget en av två öden. Det är antingen inkapslad, så att dess utveckling är blockerad (host framträder,. Figur 2 vänster), eller geting ägg kläcks, utvecklar, molts och växer till en vuxen (geting framträder,. Figur 2 till höger). L. heterotoma är en av de bäst studerade arter av Drosophila parasitsteklar. Det är en "generalist", vilket innebär att den kan utnyttja de Drosophila species som värdar 1. L. heterotoma och L. victoriae är syster arter och de producerar virus-lika partiklar som aktivt interfererar med inkapsling respons 2. Till skillnad från L. heterotoma, L. boulardi är en specialiserad parasit och utbudet av Drosophila arter den använder är relativt begränsad 1. Stammar av L. boulardi producerar även virusliknande partiklar 3 även om de skiljer sig signifikant i sin förmåga att lyckas på D. melanogaster 1. Några av dessa L. boulardi stammar är svåra att växa på D melanogaster 1 som flugan värd lyckas ofta i inkapsling sina ägg. Därför är det viktigt att ha kunskap om båda parter i specifika experimentella protokoll.
Förutom barriäreffekter vävnader (nagelband, tarm och luftstrupe), Drosophila larver har systemisk cellulära och humorala immunsvar som uppstår from funktioner blodkroppar och fettet kropp, respektive. Äggläggning av L. boulardi aktiverar både immuna armar 1,4. Blodkroppar finns i omlopp, i fastsittande populationer under segmenterade nagelband samt i lymfan körteln. Den lymfkörtelområde är en liten hematopoetisk orgel på ryggsidan av larven. Kluster av hematopoietiska celler, kallade lober, är anordnade segmentellt parvis längs ryggens kärlet som löper längs den anteriora-posteriora axel hos djuret (fig 3A). Fettet kroppen är en stor multifunktionell organ (fig. 3B). Den utsöndrar antimikrobiella peptider som svar på mikrobiell och flercelliga infektioner.
Geting infektion aktiverar immunsystemet signalering (fig. 4) 4. Vid den cellulära nivån, utlöser det delning och differentiering av blodceller. I självförsvar, aggregat och kapslar utvecklas hemocoel av infekterade djur (Fig. 5) 5,6. Activeras blodkroppar migrera mot geting ägg (eller geting larv) och börja bilda en kapsel runt den (fig. 5A-F). Vissa blodceller aggregera för att bilda noduler (fig 5g-H). Noggrann analys visar att getingen infektion inducerar den främre längst lymfkörtelområde lober för att skingra på deras periferier (Fig. 6C, D).
Vi presenterar representativa data med transduktion Toll signalväg komponenter rygg-och Spätzle (fig. 4,5,7), och dess mål Drosomycin (Fig. 6), för att illustrera hur vissa förändringar i lymfan körteln och hemocoel kan studeras efter WASP infektion . Dissektion protokollen beskrivs här ger också geting ägg (eller utveckla stadier av getingar) från värden hemolymfa (Fig. 8).
Protocol
Discussion
Intresset för parasitsteklar av Drosophila är stigande som molekylära tekniker för att avkoda hela genom att bli effektiva och kostnadseffektiva. Men i förhållande till deras exceptionellt väl studerade värdar, många fascinerande aspekter av WASP biologin fortfarande oklara. Dessa inkluderar frågor som rör värdspektrum, immunsystemet, superparasitism och beteende. Fokus för denna presentation var att visa effekterna av infektion i farten immunförsvar vävnader. Dissektionen tekniker visat här kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för professor Todd Schlenke för Trichopria drosophilae, professor Tony Ip för transgena flyga stammar och professor Carl Hashimoto för anti-Spätzle antikroppar. Vi tackar nuvarande och tidigare medlemmar av lab för deras bidrag till denna presentation. Detta arbete stöds av följande stöd: från NIH (S06 GM08168, RISE 41.399-009 och G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03.817 och 2009-35302-05277) och PSC-CUNY.
Materials
| Materials | Type | Company | Catalog number |
| Materials for insect culture maintenance | |||
| Yeast | Active dry | Fisher Scientific | S802453 |
| Fly food | Corn meal, sugar | Standard recipe | |
| Honey | Clover | Dutch Gold | |
| Vials | Polypropylene shell vials (narrow) | Fisher Scientific | AS514 |
| Vial closures | Cotton plug | Fisher Scientific | AS212 |
| Vial closures | Buzz plug | Genesee Scientific | AS273 |
| Refrigerated incubator | Precision 815 | Thermo Scientific | 3721 |
| Materials for sample preparation | |||
| CO2 tank | Bone dry grade | TW Smith | UN1013 |
| Spatula | Micro spatula (14 cm) | Fisher Scientific | 21-401-15 |
| Pyrex spot test plates | 9-well dissecting plate 85 mm X 100 mm | Thomas Scientific | 7812G17 |
| Pasteur Pipettes | Soda lime | J & H Berge | 71-5200-05 |
| Forceps | Style # 5 | Sigma | T-4662 |
| Ethanol | 190 proof USP | Fisher Scientific | 04-355-221 |
| Formaldehyde | 37% w/w | Fisher Scientific | F79-1 |
| Secondary antibody Cy3 AffiniPure donkey anti-rabbit IgG (H + L) | 1:50 Excitation 546 nm; Emission 565 nm | Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. | 711-165-152 |
| Antifade (N-propyl gallate) | 4 μg/ml in 50% glycerol in 1X PBS | MP Biomedicals | 10274790 |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Hoechst 33258 | 0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm | Molecular Probes | H-1398 |
| Rhodamine phalloidin | 200 units/ml (6.6 μM) Excitation 540 nm; Emission 565 nm | Molecular Probes | R415 |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | 300 units/ml Excitation 495 nm; Emission 518 nm | Molecular Probes | A12379 |
| Disposables | |||
| Wash bottle | Fisherbrand | Fisher Scientific | 03-409-22A |
| Kimwipes | Kimberly Clark | Fisher Scientific | 06-666A |
| Paper Towel | 1 ply C-Fold | Quill | 901-7CFTB2400 |
| Microscopy | |||
| Leica stereomicroscope | MZFLIII | Empire Imaging Systems, Inc. | 10446208 |
| Zeiss Stereomicroscope | Stemi 1000 or 2000-C | Carl Zeiss | 000000-1006-126 |
| Light Source – LED | Gooseneck illuminator | Fisher Scientific | 12563501 |
| Stage | Transmitted light box with plate | Carl Zeiss | 455137000 |
| Zeiss laser scanning confocal microscope | LSM 510 | Carl Zeiss | |
| Zeiss compound microscope | Axioplan 2 upright | Carl Zeiss |
| Wasp Strains | Fly Strains |
| Leptopilina victoriae16 | y w |
| Leptopilina boulardi 171 | UAS-GFP-Dorsal17 |
| Leptopilina heterotoma2 | SerpentHemoGal413 |
| Leptopilina heterotoma 141 | MSNF9-moCherry14 |
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP15 |
| Ganaspis xanthopoda18 | y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4 |
| y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12 |
References
- Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
- Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
- Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
- Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234 (2010).
- Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. , 243-265 (2002).
- Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from “lower” organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199 (2007).
- Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
- Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429 (2009).
- Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
- Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
- Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).
