Biomechanical विश्लेषण और ऊतक इंजीनियरिंग के लिए सेल्फ विधानसभा सेलुलर सेल व्युत्पन्न ऊतक रिंगों बनाना करने के लिए निर्देशित

Summary

यह लेख एक बहुमुखी सेलुलर आत्म विधानसभा विधि सेल व्युत्पन्न ऊतक के छल्ले बनाने की रूपरेखा. अंगूठी के आकार का agarose कुओं समग्र और 7 दिनों के भीतर मजबूत तीन आयामी ऊतकों (3 डी) के रूप में अनुबंध में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं वरीयता प्राप्त है. मिलीमीटर पैमाने पर ऊतक के छल्ले यांत्रिक परीक्षण के लिए अनुकूल हैं और ऊतक विधानसभा के लिए ब्लॉकों इमारत के रूप में काम करते हैं.

Abstract

हर साल, संयुक्त राज्य अमेरिका में रोगियों के हजारों की सैकड़ों कोरोनरी धमनी बाईपास सर्जरी से ^{गुजरना} 1 इन रोगियों के लगभग एक तिहाई उपयुक्त ऑटोलॉगस दाता रोग प्रगति या पिछली फसल के कारण जहाजों नहीं है. . संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग के उद्देश्य के लिए इन बाईपास grafts के लिए एक उपयुक्त वैकल्पिक स्रोत विकसित करने के लिए है. इसके अलावा, इंजीनियर संवहनी ऊतक संवहनी मॉडल रहने के लिए हृदय रोगों के अध्ययन के रूप में मूल्यवान साबित हो सकता है. कई हाल ही के अध्ययन और सेल आधारित विधियों के विकास के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित के साथ किया गया इंजीनियरिंग रक्त वाहिकाओं के लिए कई होनहार दृष्टिकोण का पता लगाया है, इस के ^साथ साथ 2-5. हम तेजी से 3 डी ऊतक के छल्ले में इस्तेमाल किया जा सकता है में स्वयं को इकट्ठा कोशिकाओं के लिए एक विधि प्रस्तुत इन विट्रो संवहनी ऊतकों मॉडल के लिए.

ऐसा करने के लिए, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के निलंबन दौर तली कुंडलाकार agarose कुओं में वरीयता प्राप्त हैं. agarose गैर चिपकने वाला गुण वें अनुमति देते हैंकोशिकाओं ई बसा, चारों ओर अच्छी तरह से केंद्र में एक के बाद एक जोड़नेवाला ऊतक की अंगूठी के रूप ^में समग्र और अनुबंध 6,7 ये छल्ले. यांत्रिक, शारीरिक, जैव रासायनिक, या histological विश्लेषण के लिए कटाई करने से पहले कई दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है है. हम पता चला है कि इन सेल व्युत्पन्न ऊतक के छल्ले 100-500 kPa परम तन्यता ⁸ ताकत है जो अन्य ऊतक इंजीनियर संवहनी इसी तरह durations के (<30 kPa) के लिए सभ्य constructs के लिए सूचित मूल्य से ^अधिक पर उपज 9,10 हमारे परिणाम है कि मजबूत सेल का प्रदर्शन व्युत्पन्न संवहनी ऊतक अंगूठी पीढ़ी एक कम समय अवधि के भीतर प्राप्त किया जा सकता है, और कोशिकाओं और सेल व्युत्पन्न संवहनी ऊतक संरचना और समारोह के लिए मैट्रिक्स (सीडीएम) के योगदान के प्रत्यक्ष और मात्रात्मक निर्धारण के लिए अवसर प्रदान करता है.

Protocol

1. Cell seeding mold fabrication Begin by milling a 1/2″ thick piece of polycarbonate to create 15, round-bottomed, annular wells with a center post diameter of 2 mm. The milled channels are 6 mm deep and 3.75 mm wide. Clean and dry the polycarbonate mold to remove any plastic debris from the milling process. Mix polydimethylsiloxane (PDMS) at a 10:1 ratio (w/w) of base to curing agent, degas to remove all air bubbles, and pour onto the polycarbonate mold. Degas again to remove any remaining bubbles, and cure in the oven at 60°C for 4 hours. Once cured, carefully remove the PDMS template by slowly peeling it away from the polycarbonate, wash with soap and water, and autoclave. Also autoclave a solution of two percent agarose (w/v) dissolved in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM). Place the PDMS template on a level surface and fill with molten agarose by first pipetting agarose into each of the center post molds, and then pipetting into the space around it. Allow the agarose to solidify (approximately 15 minutes), then invert the mold to release the agarose from the PDMS. Cut excess agarose from around each of the wells, and place the agarose wells into 12-well plates. 2. Cell culture and ring seeding Add cell culture media (DMEM with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin) around the outside of the agarose mold, without covering the top of the molds. Place the plates in the incubator and allow them to equilibrate for approximately 15 minutes while you prepare the cells. At 90% confluence, trypsinize rat aortic smooth muscle cells (rSMCs) and resuspend at a concentration of 5×106 cells/ml. Pipette 100 μL of cell suspension into each of the annular agarose wells, using a circular motion to apply cells to each well. Make sure incubator shelves are level, then place the plates in the incubator and allow them to sit undisturbed for 24 hours. Exchange medium every two days thereafter by aspirating the media from around the well, and re-filling each well until the agarose well is completely submerged. 3. Tissue ring harvesting and thickness measurements At the conclusion of culture, remove the ring from the agarose mold by sliding it over the top of the center post. Place the ring in a small Petri dish with phosphate buffered saline (PBS), center the sample, and acquire an image using a digital imaging system. Use an image analysis program for edge detection and measure the thickness of the ring in 4 positions (top, bottom, left and right) around its circumference. Calculate the mean thickness value (t) for each individual ring, and use this value to calculate the cross-sectional area (2π(t/2)2). 4. Mechanical testing of rings Set up the tensile testing machine (Instron EPS 1000) in the horizontal position. Attach a 1N ±1mN load cell and custom thin wire grips (created by bending stainless steel wire). Mount the ring sample on the two thin wire grips. Extend the grips until a 5 mN tare load is applied to the sample. Enter the cross-sectional area (calculated from thickness measurements) and record the gauge length. Pre-cycle the rings 8 times between the tare load and 50 kPa stress at a rate of 10 mm/min. After the eighth pre-cycle, pull to failure at 10 mm/min. Failure is noted as a decrease in force by 40% from one measurement to the next. For each ring sample, measure the ultimate tensile stress (UTS) and failure strain and calculate the maximum tangent modulus (MTM) from the acquired data. 5. Tissue ring assembly to fabricate tissue tubes Custom tube holders are machined from round 5 cm polycarbonate disks with rectangular cutouts (2 cm x 3 cm). Drill threaded holes through these disks to allow two holders to be screwed together. Autoclave the custom tube holders, and then transfer to the biosafety cabinet and place in an empty Petri dish. Use surgical scissors to cut the ends of 1.9 mm diameter silicone tubes at an angle to create beveled edges, and then autoclave the silicone tubes. While the tubes are being autoclaved, fill a Petri dish with media. Remove the rings from the agarose wells and place them in the Petri dish with media. Place autoclaved silicone tubes in the same Petri dish to wet them before use. Use forceps to place a beveled end of a silicone tube into the center of a ring and gently slide the ring onto the silicone tubing. Repeat with the desired number of rings. Slide the rings into contact with one another by gently pushing them successively in both directions along the tube. This method can be used for rings harvested after only one day in culture. Once rings are mounted, align silicone tubes within the polycarbonate holders and screw the two parts of the holder together. Place the holder in a 100 mm Petri dish and add 55 mL media. Exchange media every 3 days for the duration of culture. To remove the tissue tubes, release the silicone tubes from the polycarbonate holder and use forceps to slide the tissue tubes off the silicone tube and into a Petri dish filled with PBS. 6. Representative Results: When the protocol is performed correctly, cells aggregate to form tissue rings with an inner diameter equal to the diameter of the corresponding mold post within 24 hours. The ring edges are usually smooth in appearance and (if cultured on a level surface), are uniform in thickness around the entire circumference. The tissue rings are easy to handle and can be removed from their wells for subsequent mechanical and histological analysis (see in Gwyther et al., 20118). Tissue ring morphology, matrix composition, and mechanical properties vary depending on the number and type of cells seeded. Representative results from tissue rings made from varying cell types, seeding conditions, and culture length are shown in Table 1. Two mm ID rings created from 5×105 rSMCs exhibited a higher UTS than rings created from our previously published 2 mm rings (made from 6.6×105 rSMCs).8 Similar to rat cells, human smooth muscle cells (hSMC) readily aggregated to form tissue rings, which contained a large amount of collagen after only 14 days in culture (data not shown). Human mesenchymal stem cells (hMSC) also aggregated and formed cohesive rings, but lacked mechanical strength and broke during the initial precycling phases of uniaxial tensile testing.   n Cell number Thickness (mm) Length of culture (days) UTS (kPa) MTM (kPa) Failure strain (mm/mm) rSMC rings 6 660,000 0.94±0.12 14 97±30 497±91 0.50±0.08 rSMC rings 4 500,000 0.53±0.02 7 113±8 189±15 0.88±0.05 hSMC rings 3 750,000 0.51±0.05 14 160±30 270±20 0.92±0.08 hMSC rings 3 750,000 0.40±0.07 14 N/A N/A N/A Table 1. Table showing the culture parameters and mechanical properties of 2 mm rings generated from different cell types, seeding concentrations, and culture durations. Figure 1. (A) Schematic of the tissue ring generation process. (B) Custom polycarbonate mold with milled annular wells. Central post diameters are 2 mm. (C) PDMS template after it was peeled away from the polycarbonate mold. (D) Aggregated tissue ring cultured in an agarose mold with a 2 mm post. (E) Two mm diameter tissue ring in PBS. Scale bars = 6 mm (B, C) and 2 mm (D, E). Figure 2. Representative plot of stress-strain curve produced from uniaxial tensile testing.

Discussion

हाल ही में, वहाँ सेल आधारित या "पाड़ कम" ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ आधारित ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण की सीमाओं का कुछ पता तरीकों में एक वृद्धि हुई ब्याज दिया गया है. यह देखते हुए कि सेल व्युत्पन्न ऊतकों की कोशिकाओं से बनाई गई हैं और मैट्रिक्स वे उत्पादन, वे स्वाभाविक ज्यादा उच्च घनत्व सेल होते हैं, कोई exogenous सामग्री शामिल है, और पूरी तरह से मानव कोशिकाओं और प्रोटीन से बना जा सकता है. मानव कोशिकाओं से बना संवहनी grafts exogenous scaffolds के अभाव (जैसे, फट दबाव 3400 मानव saphenous नसों के लिए 1600 mmHg तुलना mmHg) ¹² में पर्याप्त यांत्रिक शक्ति प्राप्त कर सकते हैं. हालांकि सेल आधारित संवहनी ऊतकों सेल घनत्व में सुधार और यांत्रिक शक्ति, सबसे वर्तमान निर्माण विधियों (जैसे "शीट आधारित इंजीनियरिंग" ^3,4,12 या "bioprinting" ^5,13) एक्ज़िबिट व्यापक संस्कृति अवधि (> 3 महीने) की आवश्यकता होती है या 3 डी ऊतक निर्माण के लिए विशेष उपकरणों. सेल व्युत्पन्न ऊतक meth अंगूठीआयुध डिपो यहाँ वर्णित तेजी सेलुलर आत्म विधानसभा में सक्षम बनाता है समय की एक छोटी अवधि के भीतर और विशेष उपकरणों के उपयोग के बिना मजबूत 3D ऊतक constructs फार्म.

इस प्रोटोकॉल की प्रक्रिया हम 2 मिमी भीतरी व्यास चूहे चिकनी मांसपेशी सेल व्युत्पन्न ऊतक के छल्ले बनाने के विकसित विवरण. वर्तमान उदाहरण में, ऊतक के छल्ले 7 दिनों (तब अंगूठी संलयन और ट्यूब के गठन के लिए एक अतिरिक्त 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत) के लिए सुसंस्कृत थे. हालांकि, सेल बोने के बाद एक दिन के रूप में जल्दी के रूप में 2 मिमी चूहा (और मानव) चिकनी मांसपेशी कोशिका के छल्ले कुओं से हटाया जा सकता है (जैसे, सिलिकॉन ट्यूब पर स्थानांतरण) पर्याप्त से निपटने के लिए एकजुट हैं. इसके अलावा, भीतरी व्यास (2, 4, और 6 मिमी) के साथ अलग मजबूत ऊतक के छल्ले बस मूल polycarbonate मोल्ड के बाद व्यास बदलकर इस विधि के साथ बनाया जा सकता ^है 8 हम भी हाल ही में polycarbonate मोल्ड डिजाइन संशोधित करने के लिए 2 पाँच सक्षम . मिमी बोने के लिए एक एकल बहु – अच्छी तरह से agarose कक्ष में डाली जा कुओं, जोकम PDMS और agarose का उपयोग करता है, और 6 अच्छी तरह से एक थाली (नहीं दिखाया डेटा है) अच्छी तरह से एक में फिट बैठता है है. पोस्ट व्यास में परिवर्तन, अच्छी तरह से बोने की चौड़ाई, गोल नीचे की वक्रता की त्रिज्या, बोने, कुओं, या बोने कुओं की गहराई की संख्या सब बस सीएनसी के लिए सीएडी फ़ाइल में विशिष्टताओं को बदलने के द्वारा कर सकते हैं संशोधित किया जा polycarbonate मोल्ड के मशीनिंग. अंत में, एक एकल polycarbonate मोल्ड PDMS टेम्पलेट्स के एक असीमित संख्या बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रत्येक PDMS टेम्पलेट साफ किया जा सकता है, autoclaved और बार के दर्जनों reused किया.

ऊतक के छल्ले के आकार को बदलने के अलावा, हम कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं से छल्ले बना दिया है, सहित: प्राथमिक (सेल अनुप्रयोगों, R354-05) चूहे SMCs, प्राथमिक मानव कोरोनरी धमनी SMCs (Lonza, CC-2583), प्राथमिक मानव त्वचीय ¹¹ (डॉ. जॉर्ज पिंस के उदार उपहार, बायोमेडिकल इंजीनियरिंग के थोक मूल्य सूचकांक विभाग), चूहे फेफड़ों fibroblasts fibroblasts (RFL के 6, ATCC सीसीएल-192), और mesenchymal स्टेम सेल (Lonza, पीटी-2501). इन प्रकार सेल समुच्चय और केंद्र पदों के आसपास ऊतक के छल्ले के रूप में अनुबंध के प्रत्येक, हालांकि सेलुलर संगठन, ECM संरचना, और constructs के यांत्रिक गुणों प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अलग अलग. प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए बोने मापदंडों empirically कोशिकाओं के आकार और कुल के लिए अपनी क्षमता के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. इसलिए, जबकि सेल व्युत्पन्न ऊतक के छल्ले बनाने के इस अत्यंत बहुमुखी प्रणाली है, प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ इष्टतम ऊतक गठन के लिए मामूली समायोजन की आवश्यकता हो सकती है.

ऊतक अंगूठी ज्यामिति अक्षीय तन्यता परीक्षण द्वारा आसान लोड हो रहा है और ऊतक सामग्री गुणों के आकलन की सुविधा, के रूप में वर्णित है. वहाँ भी रक्त वाहिनियों की अंगूठी क्षेत्रों का उपयोग करने के लिए संवहनी संकुचन और शारीरिक समारोह को मापने के लिए पर्याप्त मिसाल है. प्रारंभिक अध्ययन से संकेत मिलता है कि सेल व्युत्पन्न ऊतक के छल्ले औषधीय जवाबदेही की माप के लिए एक तार myograph डिवाइस पर रखा जा सकता है है औरसिकुड़ा बल पीढ़ी (नहीं दिखाया डेटा है). कुल मिलाकर, histological, यांत्रिक, शारीरिक, और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए तेजी से आत्म इकट्ठे सेल के छल्ले बनाना करने की क्षमता एक नया शक्तिशाली उपकरण है कि संवहनी ऊतक और स्वास्थ्य और रोग में संरचना और समारोह मॉडलिंग के लिए उपयोगी हो सकता है पता चलता है.

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalog #
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Agarose	Lonza	50000
DMEM	Mediatech	15-017-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA	A05-201
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30-002-CI
Digital imaging system	DVT Corporation	Model 630
Uniaxial testing machine	Instron	ElectroPuls E1000
Edge Detection Software	DVT Corporation	Framework 2.4.6