この記事では、細胞の自己組織化による細胞由来の組織のリングを作成するには、汎用的な方法を概説します。平滑筋細胞は、リング状のアガロース井戸の集合体と7日以内に強固な3次元(3D)の組織を形成するために契約に播種。ミリスケールの組織のリングは機械的なテストに資するものであり、組織の組み立てのためのビルディングブロックとして機能する。
毎年、患者数十万人は米国の冠動脈バイパス手術を受ける。これらの患者の1約3分の1が病気の進行または前の収穫のために適切な自己ドナーの容器を持っていない。血管組織工学の目的は、これらのバイパスグラフトに適した代替ソースを開発することです。さらに、設計血管組織は、心血管疾患を研究するために血管モデルを生きているような貴重な証明するかもしれない。エンジニアリングの血管へのいくつかの有望なアプローチは、細胞ベースの手法の開発と分析に焦点を当てた多くの最近の研究で、調査されている2-5ここでは、我々がで使用できる3次元組織のリングに急速に自己集合細胞に方法を提示血管組織をモデル化するためのin vitro。
これを行うには、平滑筋細胞の懸濁液を丸底環状アガロースのウェルに播種されています。アガロースの非接着性は、目を許可するまとまりのある組織の環を形成してウェルの中央でポストの周りに、骨材との契約を決済する電子細胞。6,7は、これらのリングは前に、機械的な生理学的、生化学的、または組織学的分析のために収穫するために数日間培養することができる。我々は、これらの細胞由来の組織のリングは同じような期間(<30 kPa)の培養、他の組織工学的血管構造のために報告された値を超えて100〜500 kPa引張強さ8で得られることが示されている。9,10我々の結果は、その堅牢な細胞を実証由来の血管組織のリングの生成は、短い期間内に達成し、そして細胞および血管組織の構造と機能への細胞由来のマトリックス(CDM)の貢献の直接的および定量的に評価するための機会を提供することができます。
最近では、セルベースまたは足場ベースの組織工学的アプローチのいくつかの制限を解決するために"足場のない"組織工学の手法に関心の高まりがあった。特定の細胞由来の組織、細胞およびそれらが生産する行列から作成されていることを、彼らは本質的には外因性物質が含まれていない、非常に高い細胞密度を含んでおり、人間の細胞やタンパク質から完全に行うことができます。ヒトの細胞から作られた人工血管は、外因性の足場の不在で実質的な機械的強度(例えば、ヒト伏在静脈1600 mmHgに比べて圧力が3400 mmHgにバースト)12を得ることができる。セルベースの血管組織が 改善された細胞密度と機械的強度を示すが、ほとんどの現在の製造方法は、(そのような"シートベースのエンジニアリング"3,4,12または5,13を "bioprinting"のような)大規模な文化の期間が必要(> 3ヶ月)または三次元組織の構築のための特殊な装置。細胞由来の組織のリングメタodは短期間内におよび特殊な装置を使用せずに強固な3次元組織構造を形成するために迅速な細胞の自己組織化を可能にするここで説明する。
このプロトコルの詳細私が2mm内径のラット平滑筋細胞由来の組織のリングを作成するために開発された手順。本例では、組織のリングは7日間(その後、リングの融合と管形成のための追加の7日間培養)培養した。しかし、2mmのラットは(と人間)平滑筋細胞のリングウェルから除去し、細胞播種後の一日には早く処理(例えば、シリコンチューブへの転送)のための十分な粘着性がありますすることができます。さらに、様々な内径(2、4、および6 mm)を持つ堅牢な組織のリングは、単にオリジナルのポリカーボネート型のポスト径を変更することにより、この方法で作成することができます。8私達はまた、最近5 2をイネーブルにするにはポリカーボネートの金型の設計を変更単一のマルチウェルアガロース室でキャストするミリシーディング井戸、どの以下PDMSとアガロースを使用し、6穴プレート(データは示さず)の1つのウェルに収まります。よく、ポスト径の変化、播種の幅、丸みを帯びた底部の曲率半径、井戸のシード数、またはシード井戸の深さは、すべてのCNCのCADファイルに仕様を変更するだけで変更できますポリカーボネートの金型の加工。最後に、単一のポリカーボネートの金型は、PDMSのテンプレートを無制限に製造するために使用することができ、それぞれのPDMSのテンプレートは、洗浄オートクレーブと何十回も再利用することができます。
初代ラットの平滑筋細胞(セルアプリケーション、R354 – 05)、初代ヒト冠状動脈平滑筋細胞(ロンザ、CC – 2583)、初代ヒト:組織のリングのサイズを変更することに加えて、我々はを含む、多くの異なる細胞型からリングを行っている皮膚線維芽細胞11(博士ジョージピンの寛大な贈り物、生体医工学のWPI部)、ラットの肺線維芽細胞(RFL – 6、ATCC CCL – 192)、および間葉系幹細胞(ロンザ、PT-2501)。これらの細胞型の凝集と組織のリングを形成するためにセンターポストの周りの契約のそれぞれ、細胞の組織、ECMの構成、および構成要素の機械的性質は、各セルのタイプによって異なりますが。各セルのタイプのためのシードパラメータは経験的に細胞の大きさと能力を集約するために基づいて決定する必要があります。従って、細胞由来の組織のリングを作成するこのシステムは非常に汎用性のときに、プロトコルは、異なる細胞タイプで最適な組織形成のための微調整が必要な場合があります。
説明したように組織のリング形状は、一軸引張試験によって容易に積載し、組織の材料特性の評価を容易にします。血管収縮と生理的機能を測定するために血管のリングセグメントを使用するための実質的な先例もあります。予備研究では、細胞由来の組織のリングは薬理学的応答を測定するためのワイヤーミオグラフデバイス上でマウントできることを示していると収縮力発生(データは示さず)。完全に、迅速に、組織学的、機械的、生理学的、および生化学的分析のために自己組織化セルのリングを製作する能力は、健康と疾病における血管組織の構造と機能をモデル化するための有用である可能性が強力な新しいツールを示唆している。
The authors have nothing to disclose.
作者は感謝してCNC加工との彼の援助のためにニールホワイトハウス(WPI、ヒギンズのマシンショップ)を認める。さらに、我々は、Camtasiaの支援については、MATLABプログラミングだけでなく、ケイト飲料とジョセフCotnoir(WPI学術技術センター)との援助の彼女アドリアーナヘラを(WPI学術情報基盤センター)に感謝いたします。ソフィーバークとJacleenベッカー(WPI学術技術センター)は、補足的なビデオ映像を提供。この作品は、国立衛生研究所(R15 HL097332)、マサチューセッツ州立大学医学部 – WPIのパイロット研究イニシアチブ、米国心臓協会(JZHに学部研究フェローシップ)、及びウースター工科大学(JZHや制度への夏季留学研究フェローシップによって資金を供給された)MWRに立ち上げ資金。
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |