Den här artikeln beskriver en mångsidig metod för att skapa-cellerna vävnad ringar av cellulära självorganisering. Glatta muskelceller seedade i ringformade agarose brunnar aggregera och avtal om att bilda robusta tredimensionella (3D) vävnader inom 7 dagar. Millimeter-skala vävnad ringar bidrar till mekanisk provning och fungerar som byggstenar för mjukpapper montering.
Varje år hundratusentals patienter genomgår bypass-kirurgi i USA. 1 Cirka en tredjedel av dessa patienter inte har lämpliga autolog levererande fartyg på grund av sjukdomsprogression eller tidigare skörd. Syftet med kärlvävnad engineering är att utveckla ett lämpligt alternativ källa för dessa bypass ympkvistar. Dessutom kan konstruerad kärlvävnad vara värdefulla som levande vaskulär modeller för att studera hjärt-kärlsjukdomar. Flera lovande metoder för fartyg teknik blod har undersökts, med många nya studier med fokus på utveckling och analys av cellbaserade metoder. 2-5 Häri presenterar vi en metod att snabbt själv montera celler i 3D vävnad ringar som kan användas i vitro modell vaskulära vävnader.
För att göra detta, är suspensioner av glatta muskelceller seedade i rundbottnad ringformig agaros brunnar. Den icke-vidhäftande egenskaper agarosen gör ee celler att bosätta sig, samlade och avtal kring ett inlägg i mitten av brunnen för att bilda en sammanhängande vävnad ring. 6,7 Dessa ringar kan odlas i flera dagar före skörd för mekaniska, fysiologiska, biokemiska eller histologiska analys. Vi har visat att dessa celler som härrör från vävnader ringar avkastning på 100-500 kPa brottgräns 8 som överstiger värdet rapporterats för andra tekniska konstruktioner vävnad vaskulära odlade för liknande löptider (<30 kPa). 9,10 Våra resultat visar att den kraftiga cell -derived kärlvävnad ringen generationen kan uppnås inom en kort tid, och ger möjlighet för direkt och kvantitativ bedömning av bidragen av celler och cell-derived matris (CDM) till kärlvävnad struktur och funktion.
Nyligen har det funnits ett ökat intresse för cell-eller "byggnadsställning-less" tissue engineering metoder för att hantera några av de begränsningar schavotten tillvägagångssätt vävnadsteknik. Med tanke på att-cellerna vävnader skapas från celler och matrix de producerar, de i sig innehåller mycket högre cell densitet, innehåller inga exogena material, och kan göras helt från mänskliga celler och proteiner. Blodkärl transplantat gjorda av mänskliga celler kan uppnå betydande hållfasthet i avsaknad av exogena ställningar (t.ex. brast trycket 3400 mmHg jämfört med 1600 mmHg för mänskliga ytlig ven) 12. Även om cellbaserade kärlvävnader uppvisar förbättrade celltäthet och mekanisk hållfasthet, senaste metoderna tillverkning (t.ex. "sheet-baserade engineering" 3,4,12 eller "bioprinting" 5,13) kräver omfattande kultur perioder (> 3 månader) eller specialiserad utrustning för 3D vävnad konstruktion. Den-cellerna vävnad ring metoderOD beskrivs här möjliggör snabb cellulära självorganisering för att bilda kraftfulla 3D vävnad konstruktioner inom en kort tid och utan användning av specialutrustning.
Detta protokoll detaljer för vi utvecklat för att skapa 2 mm innerdiameter råtta glatt muskulatur-cellerna vävnad ringar. I det aktuella exemplet var vävnad ringar odlade i 7 dagar (då odlade i ytterligare 7 dagar för ring fusion och rör bildning). Men 2 mm råtta (och mänskliga) kan glatt muskulatur cellen ringar tas bort från brunnarna och är sammanhängande nog för hantering (t.ex., överföring på silikon rör) så tidigt som en dag efter cell sådd. Dessutom kan robusta vävnad ringar med olika inre diametrar (2, 4 och 6 mm) skapas med denna metod genom att helt enkelt ändra posten diameter ursprungliga polykarbonat formen. 8 Vi har också nyligen ändrat polykarbonat mögel design så att fem 2 mm seeding brunnar att vara gjuten i ett enda flera bra agaros kammare, somanvänder mindre PDMS och agaros, och passar i en brunn på en 6-brunnar (data visas inte). Förändringar i posten diameter, bredden på sådd väl krökningsradie den rundade botten, kan antalet sådd brunnar, eller djup sådd brunnar allt ändras bara genom att ändra specifikationer i CAD-filen för CNC bearbetning av polykarbonat mögel. Slutligen kan en enda polykarbonat mögel användas för att tillverka ett obegränsat antal PDMS mallar, och varje PDMS mall kan rengöras, autoklaveras och återanvändas dussintals gånger.
Förutom att ändra storleken på vävnaden ringar har vi gjort ringar från många olika celltyper, inklusive: primära råtta SMC (Cell Applications, R354-05), primära humana kranskärl SMC (Lonza, CC-2583), primära humana dermal fibroblaster 11 (generös gåva av Dr George Pins, WPI Institutionen för medicinsk teknik), råtta lung fibroblaster (RFL-6, ATCC CCL-192), och mesenkymala stamceller (Lonza, PT-2501). Alla dessa celltyper aggregat och kontrakt runt centrum inlägg att bilda vävnad ringar, även den cellulära organisation, ECM sammansättning och mekaniska egenskaper hos konstruktioner varierar för varje celltyp. Den seedning parametrar för varje celltyp måste vara empiriskt bestäms utifrån storleken på cellerna och deras förmåga att aggregera. Därför, medan detta system för att skapa-cellerna vävnad ringar är mycket mångsidig, kan protokollet behöver smärre justeringar för optimal vävnad bildas med olika celltyper.
Tissue ring geometri ger enkel lastning och bedömning av fastigheter vävnad material genom enaxlig dragprovning enligt beskrivningen. Det finns också betydande prejudikat för att använda blod segment fartyg ringen för att mäta vaskulär kontraktion och fysiologiska funktioner. Preliminära studier tyder på att-cellerna vävnad ringar kan monteras på en tråd myograph anordning för mätning av farmakologiska lyhördhet ochkontraktionskraft generationen (data visas inte). Sammantaget tyder på förmåga att snabbt tillverka egna sammansatta celler ringar för histologisk, mekaniska, fysiologiska och biokemiska analyser ett kraftfullt nytt verktyg som kan vara användbara för modellering kärlvävnad struktur och funktion i hälsa och sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) för hans hjälp med CNC-bearbetning. Dessutom skulle vi vilja tacka Adriana Hera (WPI databehandling och kommunikation Center) för hennes hjälp med MATLAB programmering, liksom Kate dryck och Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) för hjälp med Camtasia. Sophie Burke och Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) gav extra videofilmer. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health (R15 HL097332), den UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, American Heart Association (grundutbildning forskning gemenskap till JZH) och Worcester Polytechnic Institute (Summer Grundutbildning Forskning Fellowship till JZH och institutionella start medel till MWR).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |