Forniamo una guida pratica per fornire traccianti<em> In vivo</em> E usare il percorso spinocerebellare come sistema modello per dimostrare passi essenziali per il successo dei circuiti neuronali nei topi. Descriviamo in dettaglio nostro protocollo versatile di analisi che sfrutta germe di grano agglutinina (WGA), coniugata con fluorofori Alexa.
Circuiti neurali sono organizzate in funzionali mappe topografiche. Al fine di visualizzare complessa architettura del circuito, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per etichettare il modello globale di molteplici proiezioni topografiche. Il cervelletto è un modello ideale per studiare la disposizione ordinata dei circuiti neurali. Per esempio, l'organizzazione compartimentale dei spinocerebellare fibre muschio ha dimostrato di essere un sistema indispensabile per lo studio di patterning muschio fibra. Abbiamo recentemente dimostrato che il germe di grano agglutinina (WGA), coniugata con Alexa 555 e 488 può essere utilizzato per il tracciamento spinocerebellare proiezioni in fibra di muschio nello sviluppo e topi adulti (Reeber et al. 2011). Abbiamo trovato tre proprietà principali che rendono il WGA-Alexa strumenti traccianti auspicabile per l'etichettatura di proiezioni neurali. In primo luogo, fluorofori Alexa sono intensi e la loro luminosità permette l'imaging wholemount subito dopo traccia. In secondo luogo, WGA-Alexa traccianti etichetta l'intera traiettoria di sviluppo e di adulti neurali projections. In terzo luogo, WGA-Alexa rivelatori rapidamente trasportato sia in direzione retrograda e anterograda. Qui, descriviamo in dettaglio come preparare i traccianti e altri strumenti necessari, come eseguire l'intervento chirurgico per spinocerebellare tracciamento e il modo migliore per proiezioni di immagini tracciate in tre dimensioni. In sintesi, forniamo un passo-passo il protocollo di analisi che sarà utile per decifrare l'organizzazione e la connettività di mappe funzionali non solo nel cervelletto, ma anche nella corteccia, tronco encefalico e del midollo spinale.
Abbiamo descritto i dettagli chirurgiche e tecniche necessarie per il successo tracciamento degli assoni e dendriti utilizzando un nuovo approccio basato fluorescente per rapidamente l'etichettatura proiezioni neurali nello sviluppo e topi adulti. Utilizzando WGA-Alexa si mostra come traccianti e marcatori possono essere usati per analizzare la topografia del circuito modellata ad alta risoluzione e in tre dimensioni.
Traccianti molti sono disponibili per il tracciamento circuiti neurona…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da investigatore nuove start-up fondi da Albert Einstein College of Medicine della Yeshiva University di RVS.
Equipment/Reagents | Model/Catalogue number | Company |
Bead sterilizer | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | Fine Science Tools |
Cauterizer | Cat. # 18000-00 | Fine Science Tools |
Borosilicate glass capillaries | Cat. # 300056 | Harvard Apparatus |
Dual stage Glass Micropipette Puller | Model 001-PC-10 | Narishige |
Micrometer syringe | Cat. # GS-1100 | Gilmont Instruments |
Small Animal Stereotaxic Instrument | Model 940-A | Kopf Instrumentation |
Electrode Manipulator | Model 960 | Kopf Instrumentation |
Vetcare chamber | Cat. # 340508 | Harvard Apparatus |
Heating Pad | Cat. # 341241 | Harvard Apparatus |
Leica DFC360 FX camera | DFC360 FX | Leica |
Leica DFC490 camera | DFC490 | Leica |
Leica DM5500 microscope | DM5500 | Leica |
Leica DFC3000 FX camera | DFC3000 FX | Leica |
Leica MZ16 FA microscope | MZ16 FA | Leica |
CY3 Filter | Model # 11600231 | Leica |
FITC Filter | Model # 11513880 | Leica |
A4 DAPI/UV filter | Model # 11504162 | Leica |
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Cat. #W11261 | Invitrogen |
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Cat. #W32464 | Invitrogen |